生命经纬知识库 >>所属分类 >> PCR技术   

PCR基因芯片上荧光PCR反应的研究(图)

标签: PCR基因芯片 荧光PCR反应 Taqman探针 荧光染料

顶[0] 发表评论(10) 编辑词条

基因芯片技术具有快速多样、微型化和自动化等特点在生物医学领域广泛的应用。但由于其基本原理是基于核酸杂交技术,有着内在的缺陷,实验的敏感性和重复性都存在一定问题。核酸杂交较适合于检测基因的表达,不易检测基因组DNA的基因的重排,突变和缺失。而大多数肿瘤性疾病和一些遗传变异和表型的改变与后者有关。为了解决上述问题,我们将芯片技术与荧光PCR技术相结合,设立设计一种含有大量微反应池的PCR基因芯片,以期能快速、准确的对基因的重排,突变和缺失等基因变异进行检测。常规PCR反应产物的检测是电泳后观察获得基因片段的大小,PCR基因芯片的关键问题是如何检测出来在微反应池内获得的极其微量PCR产物。本文应用一些临床病例的实例标本,观察能否在基因芯片上进行不同的荧光PCR反应,如何根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异。

1、病例、材料与方法

1.1 基因组DNA标

健康成年人外周血DNA,正常脐血DNA,X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)家系成员6人外周血DNA均获自北京大学第一医院,均签署知情同意书。XLSA家系中患者为兄弟两个,年龄分别为8、7岁,都在婴儿时即发现贫血。家中有一个健康的姐姐,在两兄弟出生前,母亲曾有多次男胎自然流产史。成熟红细胞形态呈典型的小细胞低色素性贫血,骨髓铁染色可见大量环形铁粒幼细胞。临床初步诊断遗传性铁粒幼细胞贫血。

1.2 PCR基因芯片的设计与制作

PCR基因芯片上制备大量微反应室,可以同时进行不同的PCR反应。采用单抛525mm厚硅片作为衬底材料。硅片常规清洗后,在10~50℃下生长800nm厚的湿氧热氧化层,作为第一层掩膜层。然后150nm厚的Si3N4低压化学气相淀积(LPCVD)在硅片表面,形成第二层掩膜。第一次光刻,RIE刻蚀反应室及其流道上的Si3N4;采用掩膜板2光刻反应室的图形,RIE和BHF刻蚀反应室表面的SiO2。KOH腐蚀反应室的硅至150um,此时流道上的硅由于有足够厚的SiO2作为保护层,没有开始腐蚀。腐蚀掉流道上的SiO2,同时进行反应室及流道上继续SiO2的腐蚀,KOH腐蚀的速度为1um/min,芯片进行热氧化生长300umSiO2,以增强其表面的亲水性,保证反应液可以在芯片内顺利流动。芯片通过PVC聚合物压合封闭。

1.3 PCR基因芯片上应用Taqman荧光探针

1.3.1 PCR扩增XLSA家系ALAS2基因第五外显子并且获得基因片段
  经www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST查询ALAS2基因的全长序列。应用Primer3.0软件设计第五外显子引物——上游引物:5’-ccataagtcaatgactgagc-3’,下游引物:5’-aagtggtgatagaacccaag-3’。在94℃3分钟,然后94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟共30个循环,72℃延伸5分钟条件下进行PCR反应。取0.5EP管,加入7ulPCR产物及3ulSSCP上样缓冲液,96℃变性10分钟。10%SSCP-聚丙酰胺凝胶及银染色。PCR产物交上海博亚公司直接测序。

1.3.2 PCR-SSCP方法分析按照我室常规进行。

1.3.3 Taqman荧光探针 以发现的ALAS2基因第五外显子点突变为中心设计,序列如下:5’(荧光集团)FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC-TAMRA(淬灭集团)3’,设计Taqman荧光PCR反应的上下游引物。序列如下:上游引物:5’-tcagttatgaccagtttttcaggg-3’,下游引物:5’-gaacacacggtaggtgtgatcct-3’。

1.3.4 常规实时定量PCR检测ALAS2基因第五外显子基因突变在GeneAmp® SDS 5700荧光PCR仪上进行,反应条件50℃2分钟,94℃10分钟,然后94℃30秒,60℃30秒共40个循环。

1.3.5 PCR基因芯片上进行PCR反应 用0.5ml清洁医用注射器缓慢吸取Taqman荧光PCR反应液。刺破芯片表面PVC封膜,沿加样孔缓慢将反应液加入,用透明胶带封住加样孔。将芯片放入Gene Amp PCR System 2400 PCR仪,行PCR反应,探索不同反应条件。

1.3.6 PCR基因芯片上的PCR产物检测在共焦显微拉曼光谱仪(Renishaw 1000)上检测荧光。将芯片置于显微镜的载物台上,在普通光源照明下,调节载物台的垂直位置,使待探测的芯片上表面位于20X物镜的焦平面上。再调节载物台的水平位置,使反应池位于目镜视野的中心。激发光源为氩离子激光器的488nm线,检测方式是背反式。

1.4 PCR基因芯片上应用SYBR Green荧光染料

1.4.1 普通PCR反应检测20例正常人HLA-A2与非A2,应用4步位点特异性PCR反应初筛正常人HLAA2与非A2,4步反应引物如下(表1);PCR反应条件按照本室常规。

1.4.2 用SYBR Green荧光染料做常规实时定量PCR在Gene Amp® SDS 5700荧光PCR仪检测进行PCR反应初筛HLAA2与非A2,与普通PCR做对照。SYBR Green荧光PCR反应条件:94℃3分钟,然后94℃1分钟、退火温度1分钟、72℃1分钟共30个循环,72℃延伸5分钟。第一步反应的退火温度为63℃,第二步、第三步反应的退火温度为65℃,第四步反应的退火温度为64℃。

1.4.3 PCR芯片上进行SYBR Green荧光PCR反应PCR反应法同Taqman荧光PCR,探索不同反应条件。

1.4.4 在共焦显微拉曼光谱仪(Renishaw 1000)上检测荧光(方法同上)。

2、结果

2.1 本次试验的PCR基因芯片(21.3 mm×17.5 mm)由192个微反应室组成,可以同时进行192个不同的PCR反应。芯片的长方体微反应室的长度为700um,宽度为600um,深为200um,体积约为35nl。每两个微反应室之间的间距为1200um。微反应室之间由通道相连并汇集形成与外界相通的3个端口。其中较大的一个是供加入反应液用,其他较小的两个是为了能够排出气泡与过量的反应液。加样端口为主流道,又分为很多次流道,每个微反应室的入口与出口就与次通道相连,主流道宽140um,次流道宽50um。微反应室与流道腔的深度分别达到200um与50um。芯片进行热氧化后表面的亲水性增强,反应液可以在芯片内顺利流动。PVC聚合物压合封闭芯片,因为PCR芯片需要事先在其表面点入若干DNA样本或引物,封闭材料不仅有良好的导热性、密闭性、对PCR反应无抑制且在封闭过程中不能对点入的DNA样本有损。

2.2 PCR-SSCP并测序分析发现X连锁遗传性铁幼粒细胞贫血家系ALAS2基因第5外显子基因异常
  分析两兄弟及其父母、外祖父母的ALAS2基因,两兄弟ALAS2基因第5外显子的PCR扩增产物有与正常脐血不同的单链电泳条带,他们的父亲和外祖父有与正常脐血相同的单链电泳条带,而他们的母亲和外祖母同时由上述两种不同的条带。提示两患者的ALAS2基因存在异常,这一异常基因来自母系。(图1)测序表明两患者的ALAS2第5外显子有G514A的点突变,母亲为杂合子携带者。

将DNA序列测定结果在互联网上(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进行同源性分析确定两患者ALAS2第5外显子G514A点突变。

2.3 常规实时定量PCR在Gene Amp PCR System 2400 PCR仪用Taqman荧光探针能够检测ALAS2基因第五外显子点突变在Taqman探针对此家系中六位成员DNA与二份正常男性脐血DNA分析与预期结果完全相符,即:所研究家系中二名患者、外祖母、母亲为阳性;家系中父亲、外祖父以及二份正常男性脐血、阴性对照均为阴性(图2)。

图2 Taqman荧光PCR反应结果:其中1、2曲线代表所研究家系中二名患者的检测结果
3、4、5、6分别代表家系中外祖母、母亲、父亲外祖父的检测结果
0为阴性对照。1、2、3、4为阳性,5、6为阴性。2份正常男性脐血结果为阴性

2.4 Taqman荧光PCR反应能够在PCR基因芯片上进行。同样的样本在PCR基因芯片反应,结果与常规实时定量PCR反应的结果相符;即:所研究家系中二名患者(1、2)、外祖母、母亲(3、4)为阳性;家系中父亲、外祖父(5、6)以及一份正常男性脐血(7)均为阴性;0号为阴性对照(图3)。表明Taqman荧光PCR反应能够在PCR基因芯片上顺利进行。

图3  芯片Taqman荧光反应结果与常规荧光PCR反应结果完全一致
其中1、2曲线代表所研究家系中二名患者的检测结果
3、4、5、6分别代表家系中外祖母、母亲、父亲外祖父的检测结果
7代表正常男性脐血的检测结果。0为阴性对照
1、2、3、4为阳性,5、6、7、0为阴性

2.5 用SYBR Green荧光染料做常规实时定量PCR分析HLA
  应用位点特异性PCR(SCP)方法从20例正常人中确定2位HLAA2(编号1、2)与2位HLA非A2(编号3、4)。在GeneAmp® SDS 5700检测SYBR荧光染料4步位点特异PCR反应(图4);SYBR荧光染料PCR反应结果与预期相符。

图4  用SYBR Green荧光染料做常规实时定量PCR
第一步SCP反应结果:1、2为阳性,3、4为阴性

2.6 在PCR基因芯片上进行SYBR荧光染料PCR反应
  PCR基因芯片结果与常规实时定量PCR反应一致。图5示第一步SCP反应结果:1号标本为阳性,3号标本为阴性,0为阴性对照。

图5 用SYBR Green荧光染料在PCR基因芯片上第一步SCP反应结果
1号标本为阳性,3号标本为阴性,0为阴性对照

3、讨论

随着近年基因芯片技术的发展,研究者逐渐认识到基于核酸杂交原理的传统基因芯片缺陷与应用的局限性。随着PCR技术的进展,特别是荧光定量PCR技术的出现PCR技术已成为生物医学领域中应用最广泛的技术。如果一种基因芯片能直接进行PCR反应,而且能够同时扩增大批可能发生变异的基因显然会有广泛的用途。我们与微电子所合作,利用其微加工能力,首次建立含有数百上千微反应池的PCR基因芯片。近年来荧光PCR方法有所发展,我们设想在如果芯片上设置多个微反应池进行荧光PCR反应,通过检测芯片上荧光的变化来确定反应结果,可以免去电泳等繁琐的检测过程,并且可在不同反应池中同时进行多个反应。PCR反应在芯片内极小容积的微反应池中进行,每个微反应池均可以将其内部的基因扩增数百万倍,解决了常规PCR一次仅仅可以分析一种或者少数几种基因的不足。微反应池内的反应介质的量仅为普通PCR一次反应的量,也会大大节约试剂开支。

PCR基因芯片的研制面临重要问题是在仅数十纳升的微反应池中能否进行微量的荧光PCR反应?荧光的变化能否准确检测?如何选择用于不同用途的PCR反应类型?

我们利用临床病例和正常人实际例证,探讨利用Taqman探针和SYBRGreen荧光染料在PCR基因芯片上做荧光PCR反应的可行性。

TaqMan荧光探针是特异合成的寡核苷酸序列,其5’、3’分别标有荧光报告基团(如FAM)、荧光淬灭基团(TAMRA)。在PCR扩增前,TAMRA通过Föster能量迁移(FRET)作用,抑制FAM的荧光发射。如PCR产物中有靶序列存在,则在PCR扩增的延伸阶段,Taq酶通过其5’→3’外切酶活性将结合的TaqMan探针切断,FAET抑制作用被解除,后者的荧光信号得以释放出来,模板DNA每复制一次,就有一个荧光信号被释放。我们所设计的检测遗传性铁幼粒细胞贫血家系G514A点突变的探针,结果证明这类反应能在PCR基因芯片上顺利反应。在结果图中可以看出阴性与阳性结果之间差别仍很明显。但是,TaqMan荧光探针的应用仍然存在问题,大量合成TaqMan荧光探针会十分昂贵,平衡大量PCR反应的条件也是很困难的事。我们又试用荧光染料SYBR Green。SYBR Green可以与双链DNA结合。在PCR过程中,随着扩增过程的进行,双链PCR产物不断增多,越来越多的荧光染料与双链DNA结合。收集结合到双链DNA上的SYBR Green荧光信号就可以直接检测各种PCR产物的量。我们用SYBR Green荧光染料和位点特异PCR反应检测HLAA2与非A2,说明这一类型的荧光PCR反应能在芯片上应用。

TaqMan探针荧光PCR反应与SYBR Green荧光染料PCR反应各有其优缺点。SYBR Green荧光染料主要优点是不用针对每个PCR反应设计探针等,缺点是其特异性较差,原因是SYBR Green是非选择性的与双链DNA结合。幸运的是通过测定解离曲线可以排除假阳性结果。用PCR芯片检测肿瘤融合基因类型的工作中,如果无法设计数百个Taqman探针对不同的融合基因进行检测,那么SYBR Green荧光染料PCR反应则是很好的选择。可以事先在芯片上点上检测不同融合基因所需要的引物,然后将包括SYBR Green荧光染料的反应液加入,检测一个样本多个不同融合基因的变化。

我们将芯片技术与荧光PCR技术相结合,利用TaqMan探针与SYB RGreen荧光染料检测在微反应池内获得的极其微量PCR产物。用一些临床标本实例,观察在基因芯片上进行不同的荧光掺入PCR反应,发现这些荧光PCR反应可以在芯片上顺利进行,可以根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异。为PCR基因芯片的临床应用打下了基础。

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇降落PRC与巢式PCR 下一篇PCR片段拼接的SOE和SDL方法

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条