由Mullis等在1983年建立的PCR技术已成为分子生物学、遗传学等学科研究领域的经典实验方法。近年来,该技术本身获得了长足发展,可靠性不断提高,在聚合酶链式反应基本原理的基础上,发展了一系列新的概念和实验方法,在生命科学研究中具有重要价值。

实时定量RT - PCR的原理、方法和应用

1、实时定量RT - PCR的原理

实时定量PCR的发明归功于两个重要的发现:一是发现DNA Taq酶有5′ 3′外切酶活性,二是利用荧光能量传递技术构建了双标记寡核苷酸探针,即TaqMan探针。在PCR过程中,这些荧光信号可以被探测器所“即时”捕获,电脑软件可以通过等式ΔRn = R+n - R-n 计算ΔRn ,其中, R+n 是表示每点测量的荧光强度, R-n 表示荧光基线强度,ΔRn 的值表示PCR过程中,探针降解的量,就是PCR产物的量[ 。以ΔRn的值对循环数作曲线,选择一个荧光阈值,荧光达到荧光阈值的循环数叫做阈值循环数(Cycle Threshold,Ct ) ,而Ct 值随这些起始模板量的增加而线性降低,从而可以通过Ct 值推算起始模板量。该方法的特异性由引物和探针的特异性所决定,只有在PCR过程中,探针退火到目标片段才能发出荧光信号。

SYBR Green I是一种DNA结合染料,能非特异地掺入到双链DNA中去,在游离状态下,它不发出荧光,但一旦结合到双链DNA中以后,便可发出荧光,可以与任意引物、模板相配合,用于任意反应体系中,因此,在一个反应体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。它的缺点是能与非特异性双链DNA(如引物二聚体)结合,但其产生的干扰可通过熔解曲线分析得到解决 。

分子信标(Molecular Beacons) ,是一种单链DNA形成的发夹结构,在其一端有一报告基团,在另一端有淬灭基团,当它形成发夹结构时,由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近,两者之间发生荧光信号能量共振转移( FRET) ,当热循环温度达到分子信标的解链温度时,其构象发生改变,能与模板结合而完全伸展成线性分子,使得FRET消失,报告基团发出荧光信号。

Amp liSensor技术:该技术与Taqman PCR的区别在于其采用的是复合探针。一个探针上标以荧光报告基团,另一个探针上标以荧光淬灭基团,后者的5′端较前者多出7个碱基(GCGTCCC) 。两探针之间能因碱基互补而结合,此时,两基团靠近而形成FRET结构,报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。当两探针分开后,其间的FRET关系受到破坏,淬灭基团的抑制作用解除,报告基团的荧光信号得到释放。在PCR扩增前需将该复合探针与一个半套式PCR引物连接,该引物的5′端应具有一段与长探针上多出的7个碱基互补的序列,以便DNA连接酶能将该引物与短探针连接,扩增时,该探针- 引物复合物作为半套式引物掺入到模板,并释放出淬灭探针,使原有的FRET结构破坏,从而释放出报告基团的荧光信号,其强度与被扩增的模板数相对应。

L ightcycle技术:该技术的特点也是将荧光报告基团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上,形成荧光探针和淬灭探针。荧光报告基团标记探针的5′端,荧光淬灭基团标记探针的3′端,两探针能分别与模板同一条链中相邻的核苷酸序列进行杂交。当探针游离时能检测到报告基团的荧光信号,如果反应体系中存在特异性模板, PCR复性阶段两探针即会与之杂交,此时两探针上的荧光报告基团和淬灭基团相距较近,形成FRET关系,前者的荧光信号被后者吸收,即发生荧光淬灭。由于荧光淬灭的程度与被扩增的模板量相对应,可达到定量目的[ 5 ] 。
Comp lex探针技术:该技术的特点是先合成荧光探针和淬灭探针,荧光探针为25个碱基左右, 5′端有荧光报告基团,淬灭探针长度为15个碱基左右, 3′端有荧光淬灭基团,并能与荧光探针5′端杂交。当荧光报告基团与淬灭基团靠近时,荧光信号被吸收。当反应体系中没有特异性模板时,不能检测到报告基团的荧光信号。当有特异性模板存在时,在PCR复性阶段荧光探针优先与模板结合,以致两探针分离,报告基团的荧光信号可被释放出来,其强度与被扩增的模板数量成正比,因而可进行PCR定量。

2、方法

首先提取细胞因子mRNA,合成cDNA,可以采用TR Izol试剂盒,也可以采用Higher Pure RNA isolationkit从组织中提取RNA,所得到的RNA必须有较高的纯度,且不含DNA;然后,确定管家基因,设计引物和探针;再进行PCR扩增和基因定量。

3、实时定量RT - PCR的应用

实时定量PCR可用于基因表达研究,转基因研究,单核苷酸多态性及突变分析,病原体检测,药物疗效考核,肿瘤基因检测等。

原位PCR技术的原理、方法和应用

原位PCR的原理

先将细胞或组织进行处理(固定、酶消化) ,以获得适度的细胞通透性,既有利于PCR反应试剂达到靶目标,又可防止扩增后产物漏出。然后将载玻片或盖玻片放入热循环机对靶DNA等细胞内靶目标在原位进行常规PCR扩增,最后通过检测标记产物方法检测扩增产物。

原位PCR的方法

涂片。先在液相状态下对培养细胞内的靶基因进行扩增,再用标记的特异性探针进行原位杂交,该方法敏感性高,但是细胞涂片会造成细胞的变形。影响原位PCR 对细胞内靶基因DNA或RNA的准确定位。为了更好地保持细胞形态以便能更准确地对细胞内的DNA或RNA进行定位,对直接生长在载玻片或盖玻片上的细胞进行了原位PCR并获得成功,该方法与细胞涂片相比,细胞形态保持良好,而且定位准确 。

组织标本。与免疫组织化学方法一样,原位PCR技术所用的组织是冰冻切片和石蜡包埋切片。原位PCR的检测结果表明,在组织中该方法比单独原位杂交的敏感性高,同时,原位PCR可以对档案保存组织标本中的病毒进行检测和细胞定位,进行回顾性研究,便于对疾病发生和发展规律,病毒在动物体内的靶器官和靶细胞及病毒与疾病关系进行研究 。

探针的制备。在进行原位PCR之前,首先要确定所用探针的种类,原位PCR使用的探针可以从细胞中提取,也可以通过重组技术和PCR技术合成所需要的探针。探针的标记可以使用放射性同位素标记,生物素作为非放射性同位素标记物,虽然不如放射性同位素敏感,但是操作简便、安全,新出现的地高辛具有与放射性同位素相同的敏感性,而且具有非放射性标记物的安全、快速和易操作的优点。探针的长度为19～200 bp的寡聚核苷酸。

引物的设计。引物的长度为18～24 bp 的寡聚核苷酸,引物间的熔融温度Tm 的差异不超过2 ℃,同时要求较高的GC含量,这样能增加特异性。在实验时,根据扩增片段的大小,选用1对或多对引物。

组织标本的预处理

PCR扩增。原位PCR的最佳Mg2 +浓度为4. 5 mmol/L, Taq酶浓度也是重要因素,在原位PCR时,由于反应体积比液相PCR小的多,每张载片为20～30μL反应液,所需的酶量为液相的10倍以上,为减少Taq酶的用量,防止其粘附于载玻片和盖玻片的表面,常常在混合液中加入牛血清白蛋白(一般为2g/L) ,如果检测的是mRNA,则先进行反转录再进行PCR扩增。如果靶核酸是双链,就需要在杂交前必须使其变性为单链,最简单的方法是将组织切片加热至90 ℃ ,保持10 min,然后在冰上快速冷却。另一种方法是用碱(如NaOH)使核酸变性。在杂交前通常用不含探针和硫酸葡聚糖的杂交液进行预杂交,来降低探针与载玻片和细胞膜的非特异性结合以降低背景,杂交液中甲酰胺的作用是降低杂交时的温度,避免高温对细胞形态的影响。最适宜的探针浓度应能获得最强的特异信号,同时又不会引起高背景,放射性同位素标记的探针浓度为500 ng/mL,非放射性标记探针为2μg/m 。在实验过程中,应根据所选用探针的类型, GC含量和一价阳离子计算最佳杂交温度[。杂交后进行严格漂洗能除去任何被结合的非互补链,通过降低盐浓度和提高温度可以提高漂洗的严格度,用Rnase A处理可以除去未与探针结合的任何单链RNA 。固定。

原位PCR的应用

应用于病原体检测,内源基因检测,研究基因突变、基因重排和染色体移位。导入基因的检测,随着分子生物技术的发展,现在人们可以比较容易地把某一感兴趣的基因片段进行克隆,然后,通过转染载体或物理方法导入细胞或动物体内,应用原位PCR可以检测转染是否成功。原位PCR已用于基因治疗和转基因动植物等导入基因的检测和观察 。

简并PCR的原理、方法和应用

简并PCR的原理

简并PCR与一般PCR的不同之处在于,一般PCR中的引物是用给定的核苷酸序列设计的两条特定的引物,而在简并PCR中用的是由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库。其基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库,从不同生物物种中扩增出未知核苷酸序列的基因。简并引物库是由一组引物构成的,这些引物有很多相同碱基,在序列的好几个位置也有很多不同的碱基,只有这样才会和多种同源序列发生退火,以实现PCR扩增。

组织标本或细胞标本由于酶的消化从载玻片上脱落,为防止此类现象,通常对组织(或细胞)标本进行固定,现有多种固定剂可供研究人员选用,目前常用的固定剂是100 ml/L的缓冲福尔马林液和40 g/L的多聚甲醛。固定时间一般为2～24 h,固定时间过长,需要对组织过度消化以增加探针的通透性,固定时间过短易造成标本的脱落,因此,在实验时应选用优化的固定时间,在获得良好的固定时又要有利于酶的消化。在固定时为了使探针能有效地进入细胞,通常采用酶作适当消化,使细胞膜的孔径变大,有利于探针等大分子物质通过细胞膜,提高检测率。常用的酶有蛋白酶K,胰蛋白酶和胃蛋白酶,但以蛋白酶K最为常用,用量一般为1～25μg/mL。

PCR扩增

原位PCR的最佳Mg2 +浓度为4. 5 mmol/L, Taq酶浓度也是重要因素,在原位PCR时,由于反应体积比液相PCR小的多,每张载片为20～30μL反应液,所需的酶量为液相的10倍以上,为减少Taq酶的用量,防止其粘附于载玻片和盖玻片的表面,常常在混合液中加入牛血清白蛋白(一般为2g/L) ,如果检测的是mRNA,则先进行反转录再进行PCR扩增。如果靶核酸是双链,就需要在杂交前必须使其变性为单链,最简单的方法是将组织切片加热至90 ℃ ,保持10 min,然后在冰上快速冷却。另一种方法是用碱(如NaOH)使核酸变性。在杂交前通常用不含探针和硫酸葡聚糖的杂交液进行预杂交,来降低探针与载玻片和细胞膜的非特异性结合以降低背景,杂交液中甲酰胺的作用是降低杂交时的温度,避免高温对细胞形态的影响。最适宜的探针浓度应能获得最强的特异信号,同时又不会引起高背景,放射性同位素标记的探针浓度为500 ng/mL,非放射性标记探针为2μg/mL 。在实验过程中,应根据所选用探针的类型, GC含量和一价阳离子计算最佳杂交温度。杂交后进行严格漂洗能除去任何被结合的非互补链,通过降低盐浓度和提高温度可以提高漂洗的严格度,用Rnase A处理可以除去未与探针结合的任何单链RNA。

原位PCR的应用

应用于病原体检测,内源基因检测,研究基因突变、基因重排和染色体移位。导入基因的检测,随着分子生物技术的发展,现在人们可以比较容易地把某一感兴趣的基因片段进行克隆,然后,通过转染载体或物理方法导入细胞或动物体内,应用原位PCR可以检测转染是否成功。原位PCR已用于基因治疗和转基因动植物等导入基因的检测和观察。

简并PCR的原理、方法和应用

简并PCR的原理

简并PCR与一般PCR的不同之处在于,一般PCR中的引物是用给定的核苷酸序列设计的两条特定的引物,而在简并PCR中用的是由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库。其基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库,从不同生物物种中扩增出未知核苷酸序列的基因。简并引物库是由一组引物构成的,这些引物有很多相同碱基,在序列的好几个位置也有很多不同的碱基,只有这样才会和多种同源序列发生退火,以实现PCR扩增 。

简并PCR的方法

引物设计是简并PCR的关键环节,设计引物之前,最好画出要扩增基因所在基因家族所有成员的对比图,标出保守的氨基酸残基,并标记出编码每个氨基酸的密码数目,设计简并PCR引物所需要的两个必要条件:一是两段保守的氨基酸序列或DNA序列,保守氨基酸区段最好不要以丝氨酸、精氨酸和亮氨酸为主;二是蛋白质N端序列已知。一般简并性1 000～10 000倍之间较好,引物位点最好在编码最保守氨基酸的密码子序列上,用次黄嘌呤作为中和碱基,在同一个位置分别使用多个寡聚核苷酸引物库,在引物的末端要用密码子的共同碱基序列,用特定的密码子编码某些氨基酸。简并PCR的引物可用计算机软件设计,常用的软件有: Primo Degenerate 3. 4、Genefisher、CODEHOP和Simp le degenerate p rimer (U: Oregon)。

简并PCR的引物设计应遵循的几个原则

考虑所选靶扩增区的进化保守性和简并PCR的扩增特异性,选择同源性高且简并性低的氨基酸区域;选择使用率最高的密码子,进一步限定引物的简并度;引物的3′端不应存在简并,因为单碱基错配会阻碍延伸;在一些多义位置使用能与多种成分配合的脱氧次黄苷以降低简并度;引物的长度可短到对应4～6个氨基酸的长度,一般为15～20个核苷酸。模板的选择:用基因组DNA作模板的优点是待扩增基因家族的各个成员是等量存在的,并且基因组DNA比较容易获得。缺点是存在内含子,不仅会隔断引物与模板的配对,也会导致扩增产物太长不能有效扩增。cDNA尽管很难获得,但用作模板最大好处是可以预期扩增产物的大小,可以在不同大小的PCR产物中挑取所需要的PCR产物,需要注意的是:以cDNA为模板得到的正确大小的电泳带很可能是许多基因家族成员复杂的混合物,因此,在分析由这些PCR产物产生的转化克隆时必须分析很多个克隆,才可能找到所需要的基因成员。引物浓度不要大于1μmol/L, 0. 2μmol/L的浓度已经足够了。二甲基亚砜对于扩增大于1kb的产物有好处,聚乙二醇有利于低含量模板DNA的PCsR扩增。应用简并PCR获得全长基因的方法:一种是采用简并PCR扩增的cDNA小片段作为探针筛选cDNA文库,从而获得相应的目的基因;另一种方法是以此小片段为基础设计特异引物进行3′和5′cDNA末端快速扩增(Rap id Amp lification cDNA Ends, RACE) ,扩增此cDNA的其余部分,从而获得全长基因。

简并PCR的应用

在发现新基因或基因家族方面是一个非常好的方法,大多数基因都是以基因家族的形式出现,而以基因家族出现的基因往往具有一定的相似性,通过比较很多同源蛋白的蛋白序列,就会找到蛋白质的保守序列和可变序列,根据这些信息,就可以找到进行PCR的基因序列,就会发现新基因。简并PCR还可用于基因表达的检测、病毒的检测、基因组研究等。

总之,随着时间的推移, PCR技术将更加广泛地应用于分子生物学、遗传学、医学、微生物学等研究领域, PCR技术将更加科学、更加完美和实用。