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标签: PCR 技术 污染

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PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

一、污染原因

(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于 密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。

(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染。

(三)PCR扩增产物污染。这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物 污染,就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室,这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化 过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。

二、污染的监测

一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以 便采取措施,防止和消除污染。

对照试验

1、阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳 性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。

3、重复性试验

4、选择不同区域的引物进行PCR扩增

三、防止污染的方法

(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定 等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。 其实验用品及吸样枪应专用。实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.

(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸 样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染。

(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装,如有可能,PCR反应液应预先 配制好,然后小量分装,-20℃保存。以减少重复加样次数,避免污染机会。另外,PCR试剂,PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一 冰箱。

(四)防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。

(五)设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

(六)减少PCR循环次数,只要PCR产物达到检测水平就适可而止。

(七)选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前 应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻,以防管内液体溅出。

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