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减少PCR产物中引物二聚体的方法

标签: PCR 引物二聚体

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1.从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法。

2.可能模板有问题,模板浓度过小,适当加大模板量。

3.Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度。

4.将上下引物混合后,在100℃的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的。理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100℃的沸水中煮5分钟可使引物变为单链,以减少二聚体。不过有人认为在PCR仪上95度变性5min也同样达到目的,而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。

5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性。

6.PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加Taq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

7.增加循环数。

8.降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加Mg2+浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些)。

9.若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。

10.以上次的PCR产物作模板二次PCR,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍。

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