PCR-SSCP[PCR-single strand conformation polymorphism]

PCR是DNA的聚合酶链式反应，SSCP 是单链构象多态性。SSCP一般都要采用PCR扩增的方法进行检测，故名PCR-SSCP。此项技术的原理是，不同序列组成的单链DNA或RNA在非变性聚丙烯散胶凝胶中电泳，会因其空间构象不同表现出不同的迁移率。因此，可以将基因组中特定的DNA片段用PCR方法扩增，然后变性成为单链，在非变性聚丙烯酷胶凝胶中进行电泳，与对照的DNA片段进行比较，只要它们之间存在一个碱基的变异，就会表现出电泳行为的不同。显示不同PCR扩增片段电泳迁移率的方法，可采用漠化乙键染色或银染色，或用放射性同位素或荧光素标记在 PCR 引物上，然后进行检查，可提高分辨率。PCR-SSCP分析技术在检测与疾病有关的单个碱基突变、连锁分析等方面极其有用。在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾)。

1、制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固。然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用。

2、电泳

取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳。开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染。

3、银染法

将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min。用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min。用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液中显色7min。最后，用0.75%NaCO3终止显色。