免疫-PCR技术结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性,是一种极为敏感的抗原检测技术,并适合于各种微量抗原的检测。 荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段,具有很高的灵敏度。但在早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原检测上,荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏度。放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到1ng/ml,但在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护,因此限制了它在实际过程中的广泛应用。1992年,Sano[1]等人将免疫测定技术与PCR结合,创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术,即免疫-PCR(Immuno-PCR)。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处。 众所周知,PCR技自从1985年问世以来,经过十几年的发展,已成为实验室的常规技术,也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段,是一种极为敏感的放大系统。而免疫-PCR技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性,使实验中只需数百个抗原分子即可检测,甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。 1、 免疫-PCR的基本原理 免疫-PCR主要由两个部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验(ELISA)的抗原抗体反应。第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。免疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体,用颜色反应来表明阳性或阴性结果,而免疫-PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体,用PCR扩增抗体所连接的DNA,并进行电泳检测,因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR的高扩增能力,只要存在着极微量的抗原抗体反应,PCR都能大量扩增抗体所连接的DNA分子,再用电泳来表明实验结果。免疫-PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上,在抗原和DNA之间建立相对应关系,从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。最初Sano等人建立的免疫-PCR实验流程如下:(1)再包被缓冲液稀释抗原BSSA,并固定在微滴定板上。(2)微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体,并洗去未结合的抗体分子。(3)加入稀释的已与生物素化PUC19的结合的链亲和素-蛋白A嵌合体(蛋白A能与抗体结合,而链亲和素可与生物素化PUC19中的生物素结合),并洗去未结合的嵌合蛋白-Puc19复合物。(4)PCR扩增抗体所连接的Puc19。(5)琼脂糖凝胶电泳,EB显色检测Puc19. 运用这种方法,Sano等人可检测到600个BSA抗原分子。与用碱性磷酸酶作为标记物的ELISA方法相比,免疫-PCR的敏感度比ELISA高106。在这免疫-PCR系统中,链亲和素-蛋白A嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用。它的两个独立结合位点蛋白A和链亲和素分别与IgG的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合,从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系,通过PCR扩增,将抗原抗体反应的特异性高度放大。因此,免疫-PCR结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高度敏感性,成为一种极为敏感的抗体依赖的抗原检测技术。 2 、免疫-PCR的改进 虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度,但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化,因此限制了它在实际应用中的广泛普及。Ruzicka[2]等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体,用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。 此外,Sano的免疫-PCR实验流程需要众多的洗涤步骤,使实验过程相当繁琐,并需要大量的操作时间。Zhou[3]等人对此作了改进,他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验,把每个步骤的洗涤次数从原先的7~15次减至3~5次,从而减少了操作时间,但不影响实验结果的准确性。另外,用修饰过的抗原稀释缓冲液(modified antigen dilution buffer, MADB)代替Sano免疫-PCR中的TBS作为抗原稀释液,它主要把TBS中胍的浓度调到2M,由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETSI,检测浓度可达到9.6×10-15M,是常规ELISA的105倍。与Sano的免疫-PCR系统相比,Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂,生物素和亲和素(链亲和素)都已经商品化,因此在实际操作中得到广泛应用[4]。但直接包被待检抗原不适用于临床标本和难以吸附固相抗原的检测。随后在一系列实验中建立了各种夹心免疫-PCR[5~10],扩大了检测范围。然而亲和素(链亲和素)作为一个连接分子对生物素的结合具有4价特性,亲和素与生物素化DNA结合可得到5种不同产物,即游离亲和素、结合饱和亲和素和部分饱和亲和素才能在检测过程中发挥作用,游离亲和素与固相中生物素化抗体结合会降低方法的敏感性[11]。 3、 多分析物免疫-PCR 在以上的免疫-PCR实验中,生物素化的DNA通过不同的生物素结合试剂(链亲和素、亲和 |
在这偶联物中,ssDNA是连在抗体的Fc段上,因此并不影响抗体的活性。Hendrickson用此方法把设计独特的三种寡核苷酸(分别为55、85、95个碱基)分别共价连接到三种分析物hTSH、hCG、β-Gal的特异性抗体上,每一个寡核苷酸标记物含有相同的引物序列。这样,一对引物就可以促成三种DNA的共同扩增,Hendrickson用预先制备好的三种抗体-RNA偶联物同时检测hTSH、hCG、β-Gal实验使用双抗夹心模式。实验结果表明,分析物检测的敏感度超过普通ELISA约三个数量级。 由于化学合成寡核苷酸标记物序列长度不能超过100个碱基。因此,在多分析物免疫-PCR实验中,ssDNA标记物和引物的设计就受到了限制。Joerger[13]等人用dsDNA作为标记物与抗体偶联。几千个bp的dsDNA可以通过生物学和生物化学方法制备。Joerger通过PCR和单向缺失在以Puc18为基础的重组质粒上制备了各种长度、具有相同引物序列的的dsDNA,选择适合长度的dsDNA作为特异性抗体的标记物。另外,在免疫-PCR实验中,dsDNA比ssDNA具有更多的优越性。DsDNA中的一条链跟抗体的Fc段连接,另一条链在PCR第一步变性步骤中就释放到溶液中,使链复制没有空间位阻。而且dsDNA比ssDNA具有更高的稳定性。此外,长链DNA分子更容易用荧光标记和光吸收检测,并且可以引入更多的非同位素标记,序列长度的提高可以促进杂合检测。 4、 免疫-PCR扩增产物的ELISA检测 5、展望 免疫-PCR作为一种抗原检测系统,同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性、适合于各种微量抗原的检测[16],并且可以直接检测细胞上抗原[14]。预先将抗体和标记DNA偶联,简化了实验操作,并可以同时检测多种抗原。而标记物和引物被设计为带有亲和配体,则可以用常规ELISA方法进行检测。随着免疫-PCR技术的进一步发展完善,免疫-PCR的功能将得到更充分的发展,新的标记物和引物设计将扩展可检测分析的范围,简化实验的复杂性。具有侧链DNA标记物的偶联物能够承担的标记物的检测,产生更准确的结果。相信不久就会有商品化的免疫-PCR试剂盒问世。 * 作者简介:洪泽辉,男,23岁,1997年考取南京铁道医学院医学遗传学硕士研究生。 参考文献 |
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