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PCR常见问题

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PCR产物的电泳检测时间

一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性,不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量及,PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。

酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。  

反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。  

物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。  

靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增 时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳 性。需重新设计引物。  
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交 叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时,在加标本 前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩 增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:①减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量,减少循环次数。

克隆PCR产物的最优条件是什么?

最佳插入片段:载体比需实验确定。1:1(插入片段:载体)常为最佳比,摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul。室温保温1小时,或4度过夜。在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4度过夜。

PCR产物是否需要用凝胶纯化?

如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?

A)涂布未转化的感受态细胞。如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。
  B)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板。培养过夜,产生1000个菌落。转化率为: 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA。转化率为:1000克隆X10的3次方) ng /铺板1 ng DNA ug=10的6次方)cfu/ ug转化pGEM-T应用10的8次方)cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。
  C)如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑(用指定步骤10的8次方)cfu/ ug感受态细胞),表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801,M1804,M1794)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
  D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞(10的8次方)cfu/ug,按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,连接有问题。

对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?

A)连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4度过夜。
  B)插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化。为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
  C)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化。
  D)带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料(TM042)。
  E)高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞。

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