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简化抑制消减杂交(SSH)法--寻找差异表达基因

标签: SSH 差异表达基因

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无论是从一个胚胎细胞分化为不同的组织器官,或者是从正常的组织突变为肿瘤组织,都可能涉及在同一基因组 背景下不同基因的差异性表达。寻找差异表达的基因就有可能揭示细胞分化的机制或者肿瘤的成因,因而也就成为一项热门的技术。

寻找差异表达的基因有不少方法,抑制消减杂交(SSH)是比较有效的一种方法。以Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kit为例:将样品(tester)和对照(driver)的mRNA分别反转录并合成为双链cDNA后进行酶消化;样品(tester)分为两组,分别加上不同的adaptor1/2;再将两组样品(tester)分别与过量的对照(driver)杂交,两份杂交结果混合,加入过量的对照再进行第二轮杂交;补齐adaptor然后用PCR选择性扩增。由于过量的对照封闭了在样品中共同表达的基因,而在样品中特异表达的基因会被选择性地扩增出来,这些扩增的片断经过克隆 、测序后可以进行拼接或者用RACE的方法从已知片断钓全长cDNA,再做进一步的分析。

但是这一系列的操作并不简单,且得到的结果是一些基因片断,还需要进行下一步的拼接或RACE才能得到完整的基因信息,现在介绍一种简化的消减杂交的技术:以Miltenyi Biotec公司的μMACS mRNA Isolation Kit为例,在纯化对照(driver)mRNA时先将组织裂解,加入耦联了Oligo dT的磁珠悬液,混匀并立即加入放在磁场中的磁式分离柱中,磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并悬浮在磁场中,其它杂质随溶液流出。加入新鲜的wash buffer反复淋洗干净挂上mRNA的磁珠后,不用洗脱液洗脱mRNA,而是利用磁珠上的Oligo dT作为RT引物直接进行反转录反应,再用Elution buffer洗脱mRNA,得到耦联在磁珠上的对照单链cDNA库。这时将样品(tester)的mRNA加入磁珠中,共同表达的基因对应的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁场中而特异表达的mRNA不被吸附随溶液流出柱外,这部分溶液反复过柱后得到的就是差异表达的mRNA。其它的mRNA分离试剂也可有类似的用法,只是本文介绍的方法由于得到的mRNA纯度高、完整且浓度高体积小,又是层析柱式的逐级淋洗使cDNA与mRNA吸附得更充分,所以假阳性较少。

这种方法得到的是全长的mRNA,可以直接得到全长的cDNA而无需拼接DNA片断,且操作也较为简单。至于效率或假阳性率则因人而异了。

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