一 ：引物的设计

引物的设计对于这个实验至关重要，因为real time pcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：

1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。

2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。real time PCR只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。

3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。

4，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。

5，注意引物设计好后的产物长度。REAL TIME PCR的最佳产物长度在150-250kb左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大，SYBR嵌入的越多，这样才能够保证最后的荧光值比较可信）。

6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法来比较基因表达量的高低。

二： 模板的要求

归根到底，REAL TIME pcr想要检测的是目的基因表达量的高低，所以对整个实验过程中模板的质量要求必然很高，我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点：

1，用TRIZOL提取RNA有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的RNA，所以我们在提取前必须知道细胞数（一般6孔板中两个孔就可以提取出RNA）。

2，加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层（中间层为基因组DNA，对上机做REAL TIME PCR很不利，会导致起始荧光值很高，无法跑出完整的扩增曲线）。

3，提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉，但是不要过分挥发。（乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有影响。在乙醇存在的情况下，DNA更加难溶，这就是醇沉的道理。但是过分挥发，RNA又不溶于水，会造成后续反转录量不高）。

4，反转录过程的操作尽可能在冰上。我们用的是OLIGO DT18，为了尽可能的消除RNA之间的二聚体，我们将RNA和OLIGO DT18在一起70度变性10分钟后，马上冰浴2分钟，再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一个小时完成延伸过程（也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟，再加入OLIGO DT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在变性完再加OLIGO DT18时，加的比较晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义）。

5，反转录完后将cDNA -20度保存，尽可能不要反复冻融（可以以10UL为一个单位来分装cDNA）。

6，在加样的过程中需要特别注意：（1）最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上，这样可以消除不同管之间引物浓度的差异。（2）最后加模板的时候需要一把很准确的移液器，以便确保每次加进去的样一致，注意不要沾管壁（大部分人说需要混匀，但是我认为只要确保加入到体系中就可以，不用刻意混匀。因为我们在反应前有个95度变性，大家可以想象一下，在95度时候体系内的分子运动是很剧烈的，完全可以混匀），有条件的话可以加ROX,来消除不同的加样体系来造成的误差。（3）加样完毕后最好离心一下，防止沾璧。

三： 上机操作

在做整个实验之前，应该对实验有个整体的计划，每个管中所加的物质要有计划。在程序上编好号码，选好需要进行的熔解曲线（因为机器刚开始是默认为不进行熔解曲线，切记）。可以选择两步法（产物长度较小，退火和延伸都在60度完成），也可以选择三步法（产物较大，只能分为3步，且应该根据产物的长度来确定延伸时间，因为TAQ酶的延伸速度最少也在50BP/S，因此可以换算出所需要的延伸时间）。扩增完毕后进行熔解曲线，这个是必须要有的，因为这样才能鉴定你产物的特异性和有无引物二聚体。如果前几次做的话最好在做完REAL TIME PCR后将产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，来确定自己的判断。

四： 分析数据

用的比较多的是用双DELT法相对定量，而绝对定量则必须要进行标准曲线的制备，需要对这个基因构建质粒，克隆分离。所以我们对基因表达量高低用双DELT法（前提是扩增效率要一致）。熔解曲线观察，如果同一基因的熔解曲线不一样，则造成结果不一致，重复性很差，因此要多摸条件，尽可能使熔解曲线一致。

实验步骤：

1.设计引物，溶解成为10mM的浓度。

2.提取RNA，反转录成CNDA

3.常规PCR以实验所得模板扩增看家基因40个循环，电泳看产物多少。如果少，则不能进行REAL TIME PCR操作。

4.编写好程序，加样，上机。

5.分析结果。