多聚酶链式反应( PCR) 是在模板DNA、引物和4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖DNA 聚合酶的酶促反应[1 ] 。在实验室日常工作中经常出现两种情况:一种是因未找到最佳扩增条件导致产生大量非特异性产物,另一种情况是未扩增出任何产物。影响PCR 的因素很多,除了受 PCR 仪器性能的制约外,也取决于反应体系和反应条件的设置,其中Mg2+ 浓度、缓冲液pH 值、循环条件等因素尤为重要,而循环条件中的退火温度又是至关重要的因素。降落PCR 是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低[2 ] ,从而达到最佳扩增条件的方法。我们在构建人 CD137 - hIgG1Fc - pCDNA3 融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV DNA 多聚酶基因突变的过程中运用降落PCR 进行了扩增目的基因的尝试。

1 　材料和方法

1.1 　质粒含有人CD137 全长cDNA 序列的pCDNA3 质粒(CD137 - pCDNA3) ,由Herbert Schwarz 教授惠赠; 含hIgG1 FccDNA的PGEM - T质粒由第二军医大学曹雪涛教授惠赠; HBV DNA ,从6 位慢性HBV 感染者血清中抽提获得。试剂:PCR 试剂盒购自上海生工生物工程公司。引物:扩增人CD137 胞膜外区的引物P1 :5’CCC AAG CTT ATG GGA AAC AGC TGT TAC 3’, P2 :5’AAA CTG CAG CTG CGG AGA GTG TCC TG 3’;扩增hIgG1Fc 的引物P3 : 5’AAA CTG CAG TCT TGT GAC AAA ACT CAC 3’, P4 : 5’CCC GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAG 3’,扩增 HBV DNA 多聚酶的第一轮引物P5 :5’TTC CCC CAC TGT CTG GCT TTC AGT CAT 3’, P6 :5’ ATA CCC AAA GAC AAA AGA AAA 3’,第二轮引物P7 :5’TTC CCC CAC TGT CTG GCT TTC AGT CAT3’, P8 : 5’ATA CCC AAA GAC AAA AGA AAA3’由上海生工生物工程公司合成。

1.2 　降落PCR 扩增目的基因

反应体积为50μl ,人CD137 胞膜外区基因的 PCR 扩增体系: CD137 - pCDNA3 质粒4μl , P1 , P2 各015μmol/ L , MgCl2 2mmol/ L , dNTP014mmol/ L , Taq 5U ; hIgG1Fc 片段的PCR 扩增体系:含人hIgG1Fc 的PGEM - T 质粒4μl , P3 、P4 各014μmol/ L , MgCl2 2mmol/ L , dNTP014mmol/ L ,Taq 5U ; HBV DNA 多聚酶基因的PCR 扩增体系, 第一轮: HBV DNA 模板 4μl , P5 、P6 各0125μmol/ L ,MgCl2 115mmol/ L , dNTP012mmol/ L , Taq 018U ,第二轮: 取5 倍稀释的第一轮PCR 产物4μl 为模板, P7 、P8 各 0125μmol/ L ,MgCl2 115mmol/ L ,dNTP012mmol/ L ,Taq 018U 。分别在各灭菌PCR 管加入上述各反应成分,100 ℃煮沸5min ,立即冰浴5min , 加入 Taq DNA 聚合酶,混匀,离心,PCR 程序如下:

取10μl PCR 扩增产物,在2 %或3 %琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察扩增产物。

2 　结　果

分别扩增出大小为558bp 、708bp 和大小为116bp 的特异性片段, 与人CD137 胞膜外区、hIgG1Fc 片段和HBV DNA 聚合酶基因大小一致。见图1 、2 。

图1 　降落PCR 扩增目的基因M:marker ,A :人CD137 胞膜外区,B : hIgG1Fc 片段,琼脂糖浓度为2

图2 　降落PCR 检测HBV DNA 聚合酶基因突变M:marker ,1～6 :从6 位慢性HBV 感染者血清中抽提HBV DNA进行PCR 电泳条带,Pv :变异株对照质粒, Pw :野毒株对照质粒,C1 :第一轮PCR 空白对照,C2 :第二轮PCR 空白对照,琼脂糖浓度为3 %

3 　讨　论

降落PCR 是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低,从而达到最佳扩增条件的方法[3 ] ,反应过程中起始退火温度高于Tm 值,随着循环的进行,退火温度逐渐降低到Tm 值,从而确保第一个引物- 模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,退火温度最终低于Tm 值。退火温度的范围可跨越15 ℃,从高于Tm 5 ℃至低于Tm 10 ℃左右,条件允许的话,退火温度可以1 ℃或 015 ℃递降。尽管退火温度最终会降低到非特异性杂交的Tm 值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩余循环中将超过任何非特异性产物的扩增量。降落PCR 是一种潜在的一步法找到最佳退火温度的方法[4 ] ,对于Tm 值相近的PCR 反应可在同一循环条件下进行,大大提高了工作效率[5 ] 。

在降落PCR 过程中需要采用热启动的方法[6 ] ,模板量一般为104～105 拷贝。如果未检测到产物或产物带很弱,可以采取以下措施:将反应产物在恒定退火温度下再反应10 个循环并重新分析;在恒定的退火温度下对起始DT PCR 产物的10 倍稀释物(1 :10～1 :1000) 重新作30 个循环的扩增;使用更多的模板量,并在原始PCR 混合物中掺入一定稀释度的阳性模板检测其中是否存在抑制物;改变缓冲液各成分的浓度(pH、Taq 聚合酶、dNTP、引物) ; 在PCR 混合物中加入增强剂;用嵌套式引物重新扩增第1 次PCR 产物的稀释物(1 :10～1 :1000) ;放弃此套引物,重新设计引物扩增。

如果观察到许多产物带或高分子量成片产物,可采取以下措施:提高DT PCR 的最高退火温度和最低退火温度,使其范围上移;减少最低退火温度条件下的循环次数;使各退火温度下的循环数增加一个,如3 个循环1 ℃,同时减少较低退火温度或恒定退火温度循环的次数以防过多循环形成成片产物;改变缓冲液各成分的浓度(pH、Taq 聚合酶、dNTP、引物) ;纯化产物带后重新扩增;用嵌套式引物重新扩增第1 次PCR 产物的稀释物(1 :104～1 :105) ;放弃此套引物,重新设计引物扩增。