PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环,使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的,经25-30个循环后,扩增倍数可达106。Dr. Karry Mullis 1985年发明,获1993年度诺贝尔化学奖; (一)基本要素 1、Taq DNA聚合酶: 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 ①5’→3’DNA聚合酶活性; pfu DNA 聚合酶 耐热 2、Primer 本身不要出现内部互补序列形成loop环,内部二级结构如: GGGTCGATTCCTACCCATGC 注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer一般不要超过3个互补bp Primer 5’未端可修饰、突变:修饰,如:32P、生物素、荧光素,不影响其效果;突变:AGCTCCATGACCCAG 5’CGCTCCATGACCCAG 3‘ 注意:绝不可以在3’端进行上述改造 ∵DNA聚合酶是5’→3’聚合,若3’端改造→不能互补→不能延伸 primer 5’端增加碱基 3、模板: 可选:DNA |
4、dNTP: 四种脱氧核苷酸,基本原料 终浓度:50mM 5.Mg2+ TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ ,不同的酶需不同Mg2+ 6、温度和时间: (1)变性温度:94-95℃ Templete:GC比例高、长度很长,则变性T↑ (2)退火:温度越高,扩增特异性越好 取决于Tm值:Tm↑退火T↑; 若Tm较高,可使退火和延伸在同一温度 (3)延伸: £500nt---1min >500nt--3min 一般:40-60sec (二)PCR技术的应用 1. 基因检测: 2. 基因克隆化 3. DNA突变 4. DNA序列分析 |
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