PCR引物设计的11条黄金法则

一、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

二、引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

三、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

四、引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

五、引物3′端不能选择A，最好选择T.

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T.

六、碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

七、引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

八、引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。

△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

九、引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

十、扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

十一、引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

几种常用特殊PCR技术

几种常用特殊pcr技术

一、逆转录PCR（Reverse transcription－PCR,RT-PCR）

RNA经逆转录后可作为PCR的模板。逆转录PCR（RT－PCR）常用于基因表达研究（定量pcr）和逆病毒检测。

设计RT－PCR引物时，应使引物分别位于不同的外显子中，以便区别cDNA和gDNA扩增产物。

二、多重PCR（Multiple PCR）

在同一PCR反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。

例如用多重PCR进行DNA缺失筛选

三、套式PCR（nested PCR）

用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增，可以增加特异性和灵敏度。

四、非对称PCR（asymmetric PCR）

在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物，可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。

PCR产物电泳结果分析

一、PCR产物电泳产物检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

二、假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

1、模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

2、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

3、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

4、Mg2⁺浓度：Mg2⁺离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

5、反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

6、物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

7、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

三、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

1、引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。

2、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

四、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

五、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。

PCR经验总结

（先声明，此文不如分子克隆第三版权威与分子克隆相背处，请信分子克隆)

一、增加PCR的特异性

1、primers design

这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件

1）足够长，18-24bp,以保证特异性。当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量

2）GC% 40%~~~~60%

3）5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性

4）避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC

5）避免3'端的互补， 否则容易造成DIMER

6）避免3'端的错配

7）避免内部形成二级结构

8）附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端， 在算Tm值时不需要加上这些序列，但在检测互补 和二级结构是要加上它们

9）需要使用兼并引物时， 要参考密码子使用表，注意生物的偏好性，不要在3'端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)

10）最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.

引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm.确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2、stability of primers

定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM.TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

3、optimize reactants concentration

1）magnesiom ions

Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase聚合酶的活性一般 的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液

2）其他的离子

NH4+ K+都会影响PCR.增加K+的浓度后， 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度，从而降低了PCR的 严谨性(stringency)。NH4+也有相同的作用。 MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的。当然， 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时， DNA在94度根本不会发生变性， 当然也就无从谈起PCR了。

3） polymerase聚合酶

不同公司的酶效有所不同，需要operator自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些。 另外， 一般的 情况下， 变性的温度可以使用90~92度， 变性的时间也可以缩短，从而保证polymerase的活性

4）template

50ul PCR SYSTEM

human gDNA 0.1ug-1ug

E.Coli 10ng-100ng

LamadaDNA 0.5ng-5ng

Plasmid DNA 0.1ng-10ng

4、termperature

1）denaturation变性

常规是94度5分钟， GC Rich的摸板是95度5分钟，除了GC Rich外， 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟， 或者在CYCLE 1时给予较长的时间，而取消开始的denaturation

2）annealing 退火

重点到了。一般情况下， 是从55度开始。根据情况配合以Mg离子浓度进行调整。 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果。 因为， polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性。 所以在A.T.的时间过长， 会极大的增加非特异性扩增的风险。另外，在对于一些困难户， 比如从gDNA里扩增大片段， 还可使用two step PCR.

5. touchdown PCR

原理很简单，但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度

94 5min

94 30s

60 30s

72 1min 2cycles

94 30s

59 30s

72 1min 2cycles

94 30s

58 30s

72 1min 2cycles

94 30s

51 30s

72 1min 2cycles

94 30s

50 30s

72 1min 20cycles

72 5min

6、hot start PCR

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。

ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)

Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)

Magnesium wax beads (Stratagene)。

像手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。

7、 Booster PCR

我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X105幂个模板分子，这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合。 当模板的浓度过低，比如低于100个分子时， 引物和模板之间就很难发生反应。 引物容易自身进行反应形成二聚体。这样就有来了个 booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster.具体是这样的。开始几个cycles保持primer的低浓度，保证primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性。然后booste Primer的浓度到正常的水平

8、循环数和长度

确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数。因为过多的循环数容易造 成errors和非特异性产物的积累 产物的量不够， 优化的方法有:

1）增加template模板

2）增加循环数

如何确定循环数，有一个方法。做一个PCR体系，40循环，50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析。从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate)。当然是越高 越好。不过咱们大部分条件有限，就那么几台PCR仪，也没有多少挑选的余地

9、thermal cycler

PCR仪的因素我们经常容易忽视。长时间的使用后需要调整PCR仪，以保证其能够到达正确的温度。现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis)。

10）PCR additives附加物

附加物或者说enhancer实在是多种多样。 基本上包括几类， 能够增加反应退火效率的化学因子， DNA结合蛋白和一些商业试剂。 基本的原理不外是增加引物退火特异性，减少错配， 增加产物的长度和产量。在GC Rich情况中， additive可以造成配对碱基间的的不稳定，从而提高扩增的效率。而在另一种情况下，additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定， 而提高了扩增的忠实性。要注意的是，没有万能的enhancer全部通用，需要你根据自己的情况，最好结合gradient pcr选择最优条件。

dimethyl sulfoxide(DMSO) 二甲基亚砜up to 10%

formamide 甲酰胺at 5%

trimethylammonium chloride 10-100uM

detergents去污剂 such as Tween 20 0.1-2.5%

polyethylene glycol 聚乙二醇(PEG)6000 5-15%

glycerol 甘油； 丙三醇10-15%

single stranded DNA binding proteinsDNA脱氧核糖核酸结合蛋白

Gene 32 protein 1nM

E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM大肠杆菌单链DNA结合蛋白

7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP

Taq Extehder (stratagene)

Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)

Q-solution(Qiagen)

要注意的是，DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性，所以需要scouting出最适的浓度

11、Template DNA preparation DNA模板制备

提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行。因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化。特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行。 可以加入一些nonionic非离子的试剂，如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K蛋白酶K也要除干净， 不然会降解polymerase.

12、Nested PCR巢床PCR

简单点说 设计两对引物， 一对是长的， 一对是包含在长引物内的， 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板，这样可以增加产物的量。 而且可以减少非特异性带和错配的情况。

二、增加PCR的保真性

1、高保真酶

高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型

1）5'-3'方向的DNA合成能力，没有3'-5'方向的外切酶特性。如Taq及其突变体。这类酶的合成能力强，因为他不纠正合成中出现的突变

2）与a类似，有合成活性，没有3-5的外切活性。但他们能以RNA为模板，合成DNA. 如Tth DNA Polymerase

3）有DNA聚合活性，没有逆转录活性，但有3-5方向的外切酶活性。如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。

2、酶的混合物

将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。

3、其他因素

除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。