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TaKaRa RNAiso Reagent

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本制品是一种快速方便的总RNA提取试剂,可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA。样品在RNAiso Reagent中能够充分被裂解,在加入氯仿离心后,溶液会形成上清层、中间层和有机层(下层),RNA分布在上清层中,收集上清层后,经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。

RNAiso Reagent具有很强的广谱性,可以适用于各种样品的总RNA提取,提取过程方便快速,整个操作在一小时内便可以完成。经本制品提取的总RNA纯度高,基本不含蛋白质及基因组 DNA,提取的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。

【试剂盒之外所需准备试剂】

氯仿、异丙醇、75% 乙醇( D E P C 处理水配制) 、RNase-free水(制备方法:使用RNase-free的玻璃瓶,向超纯水中加DEPC至终浓度0.01%(v/v),过夜搅拌后,高温高压灭菌。)

保存和运输

1. RNAiso Reagent在室温下可以保存12个月,为保证试剂质量,建议于2-8℃下避光保存。

2. 可以在常温下运输。

RNA提取实验前的准备

RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此,在实验中必须采取以下措施:戴一次性干净手套;使用RNA操作专用实验台;在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理。

1. 用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下处理12小时。

2. 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用,不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂,须使用干热灭菌(180℃,60分钟)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器),使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用,避免混用后交叉污染。

实验操作

1. RNAiso Reagent的使用量情况如下。

 

2. 实验样品的研磨和匀浆。

A. 贴壁培养细胞

① 倒出培养液,用1×PBS清洗一次。

② 每10 cm2 生长的培养细胞中加入2 ml的RNAiso

Reagent,水平放置片刻,使裂解液均匀分布于

细胞表面并裂解细胞,然后使用移液枪吹打细胞

使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。

③ 将内含细胞的裂解液转移至离心管中,用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④ 室温静置5分钟。

B. 悬浮培养细胞

① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中,8,000 g 4℃离心2分钟,弃上清。

② 向每5×106 个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。

C. 动物组织、植物材料样品

① 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。

② 对于普通的RNA提取样品,可以向研钵中加入适量的RNAiso Reagent,将研磨成粉末状的样品完全覆盖, 然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品,如肝、脾、骨及软骨等,可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Reagent的匀浆管中,把匀浆管置于冰浴中进行匀浆,直至匀浆液呈无颗粒透明状。

③ 将匀浆液转移至离心管中,室温静置5分钟。

④ 12,000 g 4℃离心5分钟。

⑤ 小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。

③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④ 室温静置5分钟。

3. 总RNA的提取。

① 向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Reagent的1/5体积量),盖紧离心管盖,用力震荡(氯仿沸点低、易挥发,振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,再室温静置5分钟。

② 12,000 g 4℃离心15分钟。

③ 从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。

④ 向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15~30℃下静置10分钟。

⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后,试管底部会出现沉淀。

4.RNA沉淀的清洗。

小心弃去上清,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇l ml(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量,应尽量除净乙醇)。

5. RNA的溶解。

室温干燥沉淀2~5分钟(不可以离心或加热干燥,否则R N A 将会很难溶解, 有关R N A 溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明),加入适量的RNasefree水溶解沉淀,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀,待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

RNA提取操作流程简图

FAQs

[Q1] 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量如下表:

[Q2] 有关RNA的吸光度说明如下:

260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280(R)体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度,质量较好的RNA的R值应在1.8~2.0之间,当R<1.8时,溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显;当R>2.2时,说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时,需要注意稀释液应使用TEBuffer。

[Q3] 如何计算RNA的浓度?

RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl。

[Q4] 提取的RNA中含有多糖怎么办?

大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖,其理化学性质与RNA十分接近,因此很难将其从RNA中除去,使用此类组织材料提取RNA时,建议增加RNAiso Reagent的使用量。

[Q5] RNA提取量较低怎么办?

① 向组织材料中加入RNAiso Reagent后,请充分研磨匀浆使其充分裂解。

② 相分离后请尽量完全回收上清液。

[Q6] 提取的RNA不溶怎么办?

① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。

② 可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。

③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时,应注意在相分离后吸取上清液时,不要让枪头接触蛋白层。

④ 溶解液更换为0.5%的SDS溶液(DEPC处理水配制)。

[Q7] OD260/OD280值<1.65,为什么?

① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定,低离子强度或低pH值会使OD280值升高。

② 样品裂解时加入的RNAiso Reagent量偏少,造成蛋白变性不充分,可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提,以除去蛋白。

③ 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置,或静置的时间不足5分钟。

③ 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶,而RNAiso Reagent的添加量不够。

④ 相分离后,吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。

⑤ RNA未充分溶解。

[Q8] 提取的RNA降解,为什么?

① 使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料,或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。

② 提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。

[Q9] 提取的RNA中含有DNA污染,为什么?

① 裂解组织或细胞使用的RNAiso Reagent量偏少。

② 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂(如:乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。

③ 如果提取的RNA中含有DNA时,可以使用DNase I

(RNase Free;TaKaRa Code:D2215)进行DNA消化。

■ 参考文献

1. J. Chirgwin et al, "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease", Biochemistry.18(24): 5294-5299(1979).

2. D. Wallace, "Large-and Small-Scale Phenol Extractions", Methods in Enzymology.152: 33-41(1987).

3. Coombs, L. M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann,M., Denner, J. and Knowles, M. A. "Simultaneous Isolation of DNA, RNA, and Antigenic Protein Exhibiting Kinase Activity from Small Tumor Samples Using Guanidine Isothiocyanate", Anal. Biochem.188:338-343 (1990).

4. Nicolaides, N. C. & Stoeckert, Jr., C. J. "A Simple, Efficient Method for the Separate Isolation of RNA and DNA from the Same Cells",Biotechniques. 8: 154-156 (1990).

5. J. R. Feramisco, et al., Molecular Cloning: 194-195, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

6. Raha, S., Merante, F., Proteau, G. and Reed,J. K. "Simultaneous Isolation of Total Cellular RNA and DNA from Tissue Culture Cells Using Phenol and Lithium Chloride", Gene Anal. Techn. 7: 173-177 (1990).

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