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实验步骤
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实验原理
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| 1 |
所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。 |
去除RNA 酶（外源）的影响。 高温灭菌两次可以破坏RNA 酶的复性过程.虽然RNA 酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA 酶失活。 DEPC是RNA 酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA 酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA 酶失活。 因为DEPC能与RNA 的N结合，从而修饰RNA ，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA ，实验时应避免。） DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。 实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。 |
| 2 |
在一灭菌2mL管中加入: 5mol/L异硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL |
必须提前准备好变性剂。 异硫氰酸胍可以变性RNA 酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA 酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA 在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA 和RNA 都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。 苯酚用于抽提DNA 和蛋白质。 |
| 3 |
称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。 剧烈震荡。 |
低温防止内源性RNA 酶降解RNA 。 剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA 没有水解RNA 的机会。 小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。 |
| 4 |
混匀,冰浴30min。 |
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| 5 |
4℃,12000rpm,10min。 |
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| 6 |
上清至另一离心管中 加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。 |
去脂类。 |
| 7 |
40C,12000rpm,10min。 |
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| 8 |
弃有机相（下层） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。 |
去脂类和蛋白质。 |
| 9 |
40C,12000rpm,10min 弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。 |
去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/L NaAc），所以可以使RNA 沉淀。 |
| 10 |
40C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗两次。 |
因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。 |
| 11 |
室温稍干燥。 |
RNA 是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。 |
| 12 |
沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存) |
DEPC水中不含RNA 酶。 |
| 13 |
RNA 电泳 ： 1%琼脂糖胶20 mL 8μL样品 1μL样品缓冲液 1μLSYBR 100V恒压电泳 测OD260 和OD260 /OD280 |
