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DNA连接反应的影响因素

标签: DNA连接

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1、 连接缓冲液的影响:大体上缓冲液含有以下组分:20-100mmol/L的Tris-HCl,较多用50mmol/L,pH的范围在7.4-7.8,较多用7.8,目的是提供合适酸碱度的连接体系;10mmol/L的MgCl2,作用是激活酶反应;1-20mmol/L的DTT,较多用10mmol/L,作用是维持还原性环境,稳定酶活性,25-50ug/ml的BSA,作用是增加蛋白质的浓度,防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP,现多用1mmol/L,是酶反应所必需的。

2、 pH的影响:一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8,较多用7.8。有实验表明,若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%,那么体系偏碱(pH为8.3)时仅为全部活力的65%;当体系偏酸(PH为6.9)时仅为全部活力的40%。

3、 ATP浓度的影响:连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间,较多用1mmol/L。研究发现,ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L,过浓会抑制反应。例如,5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接,黏端的连接也有10%被抑制;还有报道,当ATP的浓度为0.1mmol/L时,去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解,所以当连接反应失败时,除了DNA与酶的问题外,还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20℃保存,溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存,防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是,含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效,所以也可自行配制不含ATP的缓冲液(可长期保存),临用时加入新配制的ATP母液。

4、 连接温度与时间的影响:因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用,所以温度过高会使氢键不稳定,但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾,在经过综合考虑后,传统上将连接温度定为16℃,时间为4-16h。现经实验发现,对于一般的黏性末端来说,20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果,当然如果时间充裕的话,20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的,可使用较高的温度,使酶活力得到更好的发挥。

5、 酶浓度的影响:日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍,连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。进行黏末端连接时需先行稀释,稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似,稀释液中的酶能在长时间保持活力,也便于随时取用。

6、 DNA浓度的影响:要求得到环化的有效连接产物, DNA浓度不可过高,一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物, DNA的浓度可以高些,至少是接近推荐的浓度。在用大质粒载体进行大片段克隆时,以及在双酶切片段的连接反应中,DNA浓度还应降低,甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究,T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L,所以,连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。

提高平端连接效率的方法:

1、 低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好,平端连接需要过夜反应。

2、 在体系中加一点切载体的酶,只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连,应该可以大大提高平端连接的效率。足够多的载体和插入片段是最重要的 。要看片段具体情况而言,有时载体和片段浓度过高,容易产生线性化产物,不利于环化的。插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍,这个很关键。载体通常50ng就够了,若载体在10k左右,可用50-100ng。

3、 平端的连接对于离子浓度很敏感,回收的时候多洗洗,加PEG和扩大酶量,22度2小时后4C过夜。

4、 尽可能缩小连接反应的体积,最好不超过10微升,在5、6微升左右最佳。

5、 建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。

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