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RNA提取心得

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一、组织RNA提取

1. 最好新鲜组织,这样RNA提取的效果比较好,这是肯定的。

2. 如果不是新鲜的(最好在半年之内,-80°或者液氮中冻存的)组织,注意不要反复冻融,从冰冻状态拿到0-4°,注意不要拿到常温,待组织解冻后,用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织,称重后,放到预冷的匀浆器中,然后加入一定量的TRIZOL试剂,然后匀浆。注意:速度不要太快,要匀一会停一会,否则由于摩擦产热,RNA遇热会加速降解。如果一次做多个标本的RNA提取,也要这样做,更不能急。后面的步骤和细胞RNA提取一样。

二、培养细胞的RNA提取

1. 贴壁细胞,需要先用胰酶消化后,然后收集到离心管中,离心,去上清,然后用PBS多洗2-3次,以去除多余的胰酶。

悬浮细胞,直接用吸管或者加样枪吹打评壁,以使细胞基本可以被吹下来。然后离心去上清,不需要用PBS洗。

2. 然后将少量细胞悬液转移到预冷的DEPC泡过的1.5毫升EP管中,然后加入一定量的TRIZOL(细胞多的话加1毫升,细胞少的话加0.5毫升就可以),然后用枪头吹打混匀5-10分钟。(如果有时间就继续往下做,如果没有时间,可以把加了TRIZOL后的细胞裂解液冻存到-80°,用的时候提取和新的提取的效果一样。)在冰上操作。

3. 上面的混匀5-10分钟,基本可以使细胞裂解,然后可以进行下面的步骤,详细的步骤我就不介绍了。

注意事项

1. 一定要注意冰上操作,低温离心。

2. 戴口罩和勤换手套,去任何东西都要带着手套去取。

3. 每次去器材的时候都要用镊子去夹,镊子要在酒精灯上烧一下。

4. 所有的器材都要经过DEPC浸泡后高压后才可以使用,所需要的氯仿,酒精,异丙醇等都保证没有被RNA酶污染,不能用没有泡过DEPC的枪头去提取液体,一定要用DEPC浸泡过的枪头去吸,如果发现试剂有可能被污染了,要立即更换。

5. 吸取上清一定不要吸到中间层的蛋白,如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提,因为,吸到的蛋白很可能会对RNA产生降解作用。一定要少吸,不要贪多,RNA提取不要求量,更多的要求质。

6. 最后用75%的酒精洗一次就可以,尽量减少RNA提取时间。

7. 最后一步,用DEPC水溶解RNA,不要用太多的体积,以保证RNA的浓度。

8. 提取完后,电泳观察结果,如果上面的两条带都比较清楚的话,说明RNA提取的不错,可以一次多逆转录几管,不要把RNA冻存,以后在逆转录的效果不好。

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