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标签: mRNA 纯化

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mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3‘末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。

寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA:

试剂试剂:

1、3M醋酸钠(pH 5.2)

2、0.1M NaOH

3、1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%.

4、洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS

5、无水乙醇、70%乙醇

6、DEPC

试验步骤:

1、将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。

2、用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管,将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。

3、使用1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液pH值小于8.0.

4、将RNA溶解于DEPC H2O中,在65℃中温育10min左右,冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后,再用1×上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。

5、将所有流出液于65℃加热5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。

6、用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱,每管1ml分部收集,OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高,其内含物为无Poly(A)尾的RNA.后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。

7、用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA,分部收集,每部分为1/3-1/2柱体积。

8、OD260测定Poly(A+)RNA分布,合并含Poly(A+)RNA的收集管,加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置30min.

9、4℃离心,10000g×15min,小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意:此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心,10000g×5min,弃上清,室温晾干。

10、用适量的DEPC H2O溶解RNA.

注意事项:

1、整个实验过程必须防止Rnase的污染。

2、步骤4中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。

3、十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl.

4、寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存,反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。

5、一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%.

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