仪器用具:微量离心机 药品试剂: Plasmid DNA 酵解产物: #1 (pBlueGus/HindIII), #2 (pBlueGus/BamHI);Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) 以下简称为PCI;Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) 以下简称为CI;3 M NaOAc (醋酸钠pH 5.2);纯酒精及70%酒精 方法步骤: ◆ 注意!进行这一部份实验的前,请先确定pBlueGus/HindIII 与pBlueGus/BamHI 两者的酵解反应都已经完全。 1) 于酵解反应 #1 与 #2 的微量离心管分别加入182 μL 去离子水。 2) 以200 μL PCI 萃取一次,亦即加入PCI 后,以Vortex 震荡混合,并在室温离心3 min。 3) 以微量移液器P200 将上层液移至新的微量离心管。 4) 加入等体积的CI,以Vortex 充分震荡混合,并在室温离心3 min。 5) 以微量移液器P200 将上层液移至新的微量离心管。 6) 加入0.1 倍体积的3 M NaOAc (pH 5.2) 及2.5 倍体积绝对酒精。 7) 置于 -20℃过夜,或于 -80℃放置30 min,以便沉淀DNA. 隔天: 1) 自冷冻柜取出微量离心管,以14,000 rpm 离心10 min。 注意: 请利用这一段时间参照『基本操作技术』所描述的步骤准备一片1.2%洋菜胶体。 Ethidium bromide 是一种强力致癌物质,严禁戴着手套到处乱摸! 2) 小心地倒出上清液。 3) 徐徐加入0.5 mL的70%酒精 (预先放在 -20℃预冷)。小心不要动到DNA沈淀。 4) 以14,000 rpm 低温离心5 min 的后,倒去上清液,并将微量离心管倒置于一张干净的卫生纸上30 min,以便风干DNA.也可以用SpeedVac 干燥DNA,但应小心处理,以免DNA 沉淀不见了。 5) 以10 μL dH2O/DEPC溶解DNA。 6) 依照下表,自pBlueGus/BamHI 与pBlueGus/HindIII 各取1 μL DNA 以洋菜胶体电泳进行分析,并估算其浓度。 DNA 浓度的估算请以 DNA/HindIII 量为参考值。 |
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