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通过不连续或预先形成的氯化铯（CsCl）梯度离心，可在离心管中获得含有不同浓度CsCl的溶液分层，样品位于中层（三级梯度法）或底层（两级梯度法）。在随后的离心梯度梯度形成过程中，DNA找到其等密度点，从而使离心时间大大缩短。因为不连续梯度法不能达到真正的平衡，使其闭环DNA与染色体DNA之间的分辨率不如自身形成的梯度那么高。一般说来，与二级梯度法相比三级梯度法能在较短的时间内给出更好的结果。