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重组子的筛选

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根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落,因而易于识别。然而,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后,有重组质粒的细菌形成白色菌落。

这和受体菌:质粒DNA的选择相关, 原则上要注意:

1、 受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株;

2、 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定;

重组子的筛选方法常用的有两种方法:

1、 抗生素筛选法:菌株为某种抗生缺陷型, 而质粒上带有该抗性基因(如氨苄青霉素, 卡拉霉素等)这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。本实验利用抗生筛选转化子。

2、 互补法:现在使用的许多载体(如PUC系列)有含有一个大肠杆菌DNA的短区段,其中含有β-半乳糖苷酸基因(lacZ)的调控序列和头146个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β-半乳糖苷酶C端aa的序列。当外源基因插入时,二者溶为一体后,有β-半乳糖苷酶表达, 在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(x-gal)培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点,从而造成插入失活,而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。

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