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DNA合成常见问题及解答

标签: DNA合成

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Q: 怎样对合成DNA制品进行定量?

A: DNA的量与260 nm处的吸光度值(OD值)成正比,因此使用紫外分光光度计定量是最科学的。1个OD值的合成DNA的重量约为33 mg。

Q: 怎样理解测定的OD值?

A: 进行OD值测定时,分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。当测定200 ml溶液中的OD值为1.5时,溶液整体的OD量应该为多少?此时的OD值

= 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD。

Q: 合成Oligo DNA应怎样保存?

A: 保存合成的Oligo应该注意以下几点:

1. 干燥制品很稳定,常温下数个月无问题。但为保证万无一失,放置于-20℃保存为好。

2. 溶解后的溶液DNA短期内(1-2周)使用可放置在4℃下保存,长期保存请放置于-20℃。溶解DNA时,请注意使用无菌、无核酸酶的水或TE Buffer。

3. 荧光标记引物请避光保存。

Q: 合成DNA溶液在室温下放置了数天,还可以使用吗?

A: 溶液中的Oligo DNA常温下数天(3-4天)应该没问题,但最好不要放置一个星期以上。其寿命受溶液中的菌体、核酸酶等的影响。

Q: 制品溶解后发现有少许沉淀,会影响实验结果吗?

A: 所有的制品纯化后都要进行脱盐,脱盐是使用C18柱进行的,偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果,请稍许离心后取上清使用。

Q: 测定了制品的OD值后发现A260/A280< 1.8,制品质量(纯度)合格吗?

A: Oligo DNA和一般提取的双链DNA不同,A260/A280的比值不能准确衡量Oligo

DNA制品的质量,该比值依赖于序列中的各种碱基的组份,下表中列出了不同碱基组成的20mer的Oligo DNA的A260/A280比值。

因此,如果您测定了A260/A280的比值小于1.8时,是由于上述原因引起的。

Q: 为什么PAGE级和高纯度级制品的提供量比其他公司少?

A: 无论是PAGE纯化,还是HPLC纯化,增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以,为了保证制品质量,我们一般把每次的纯化量控制在2 OD左右。大OD量的提供对提高纯度是不现实,不科学的做法。

一般,1 OD的20mer的DNA制品 (约5 nmol),可以进行200-400 次的PCR反应 (50 ml体系),以及1,400次的测序反应。因此,2 OD 的DNA量可以足够进行一般的实验工作。

Q: 我公司的DNA制品包装中为什么不提供电泳照片?

A: 进行过Oligo DNA PAGE电泳的人员都知道,同一OD量的不同序列的DNA制品电泳时的泳带亮度(清晰度)是不一样的。原因在于EtBr等染色剂的染色是渗透至DNA的双链之间的,而合成的Oligo DNA是单链,Oligo DNA自身形成的立体结构越复杂,EtBr的染色就越容易,DNA带也就越亮。相反,有一些Oligo DNA由于不形成立体结构,根本就不为EtBr所染色。因此,我们认为有些公司对所有产品都提供差不多同一亮度的制品的电泳照片是非常不现实的做法。

Q: 使用3%的Agarose凝胶电泳合成Oligo DNA制品,发现有很多条泳带,为什么?

A: Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带(更无法用Agarose电泳进行定量了)。

Q: 进行PAGE电泳时,长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

A: 我们分析后认为主要有以下原因:

1. A、G、C、T的组份不同,电泳速度不同;

2. DNA的立体结构不同,电泳速度不同。

这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生,长链Oligo DNA之间差别较小。

Q: PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,为什么?

A: 大部分厂家的说明是:1. PCR过程的错配;2. 克隆过程的突变。

我们不能否认这种可能性,但这种可能性实在太小,几乎不可能。 对这种情况,我们经过了认真的分析,总结出了以下一些原因,供参考。

1. 合成机管路的瞬时阻堵,造成化学反应的瞬间中断,其结果可能会发生单个(或一部分)碱基的缺失。

2. 计算机程序失灵,控制错误合成。

3. 合成过程中,碱基附加至DNA片段之前,碱基和碱基之间发生了偶联,然后再附加到了DNA片段上,造成多碱基现象。

4. 合成时碱基G可能会转化成烯醇异构体,此时进行PCR反应时G会转变成A。

5. 合成过程中的脱嘌呤作用,对脱嘌呤后的碱基DNA聚合酶不能识别,此时可能观察到A或G的缺失。嘌呤含量越高,就越容易发生这种情况。

6. 不完全的脱保护结果。通常C脱得快,G脱得慢。不完全脱保护会发生碱基缺失。

7. 合成过程中的Capping(盖帽)反应不完全,使短片段DNA继续参与合成,造成碱基缺失。

应该说,上述这些情况发生的可能性都极低。然而,合成的DNA链越长,发生这种情况的机率也就越大。

Q: PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,怎么办?

A: 1. 因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,也许结果会变好。

2. 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物。

进行蛋白表达实验数个月不成功,后经测序发现引物处有错误, 怎么办?

1. 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证,这是实验的常识。

2. 我们可以免费重新合成引物。

3. 如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。

Q: 怎样才能保证Oligo DNA的正确性?

A: 1. 合成Oligo DNA时,选用高纯度级制品。

2. 避免使用大于50mer的长链Oligo DNA,最好选用小于35mer的合成DNA制品。

3. 进行克隆实验时,每次克隆都须进行测序验证,以保证序列的正确性,然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时,尤其需要注意。

Q: Oligo DNA最长可以合成多少个碱基?

A: 以每步反应效率为99%进行计算,粗略计算合成到100个碱基时,目的DNA片段的比例便为0 (精确数为37.0%)。但有些厂家曾报道合成了150mer的Oligo DNA片段。TaKaRa公司也曾合成过120mer左右的Oligo DNA制品。但根据我们的经验,要想保证合成DNA的碱基100%正确,Oligo DNA的长度最好不要超过70mer,80mer以上要想保证一个碱基不错就非常危险了,须十分注意。

Q: 一般的合成Oligo DNA的5'和3'末端有P吗?

A: 没有,5'和3'末端均为-OH基。如需要加P,订货时请特别注明,此时需收取加P (P修饰) 的费用。

Q: 平端的PCR产物难以克隆,为什么?

A: 由于一般的PCR用引物的5'末端都没有P,因此,扩增后的PCR产物的5'末端也没有P。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时,无法克隆进去;而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时,背景会极高。此时请对PCR产物的5'端进行磷酸 (P) 化处理。

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