生命经纬知识库 >>所属分类 >> DNA技术   

DNA斑点杂交系列(二)-实验举例

标签: 斑点杂交 DNA 实验

顶[0] 发表评论(32) 编辑词条

一、实验原理

用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。

二、实验步骤

1. 处理:

将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后,夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。(将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作)

2. 变性:

【原理】 使DNA样品变性,即双链DNA→单链DNA。

将待测DNA样品(HCV经RT-PCR扩增产物;HBV的PCR扩增产物作为阴性对照,每组两种样品各10μL)置于PCR仪中100℃加热10min,立即置冰中,并置于-20℃冰箱中骤冷5min。(每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。) 

3. 点样:

【原理】 使样品中的DNA与膜结合牢固。

将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上,室温下风干后,于烤箱中120℃烘烤30 min。

4. 预杂交:

【原理】 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。

将杂交膜封入杂交袋中(每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中),做好剪角标记(勿过大)。用1000μL加样器,加入预杂交液(Dig Easy Hyb),每组5mL全部加完,使尼龙膜恰恰漂起即可,若5mL预杂交液不足,可适当补加。除去气泡,置42℃恒温摇床上,轻轻振摇30min-60min.  5. 杂交液制备:用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释,即为杂交液。  (已准备好)

6. 杂交:

剪开杂交袋一个小角,倾去预杂交液,加入杂交液2-3mL,除去气泡,封口。置50℃恒温摇床上,轻轻振荡过夜。

7. 洗膜:

【原理】洗去未结合的探针,否则会导致过高的本底。 

(1)回收杂交液; 

(2)室温下,用2×wash solution洗膜两次,每次5min;

(3)将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次,每次15min。

 8. 封闭:

取出膜,在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后,转入30mL BufferⅡ中,室温作用30-60min。

【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。  (在此阶段末期,准备下一步的抗体稀释。稀释方法:加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后轻轻混匀,4℃ 可保存12h.)

9. 酶联抗体结合:

将杂交膜封入一个新的杂交袋中,加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室温作用30min,经常摇动,使酶联抗体与地高辛结合。

10.洗膜:

(1)取出膜,将膜放入含有30mL BufferⅠ的培养皿中,洗膜两次,每次15min。

【原理】洗去未结合的酶联抗体。

(2)取出膜,将膜放入含有20mL BufferⅢ的培养皿中平衡2min。

11.显色:

(1)将45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中,(注:显色液必需现配现用!)

(2)在10mL新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时,常在12h内完成显色反应。

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇胶回收的心得体会 下一篇Frozen competent E. coli cells 【Carnegie Institution of Washington】

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条