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标签: 差示反转录PCR mRNA

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mRNA差异显示技术是由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年创立的。它也称为差示反转录PCR(differential display of reverse transcriptional PCR)简称DDRT-PCR。mRNA差异显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术,具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品,该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。其基本原理是,几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端,都带有一个多聚的腺苷酸结构,即通常所说的poly(A)尾巴。因此,在RNA聚合酶的作用下,可按mRNA为模板,以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到,在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基,除了为A的情况之外,只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征,P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物,它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成,用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示,这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是,采用这三种引物,可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增,因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的,可以在测序胶上明显分辨开来,从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。

随着mRNA差异显示技术的广泛应用,也逐渐显露出一些不足之处,如所得特异性cDNA片段克隆的假阳性的比例较高,差异条带分离困难,获得的差异扩增片段一般在100bp~600bp太短之间,包含大量的非编码序列,不利于同源性比较分析等。

以下是以红豆杉为例进行mRNA差异显示研究的具体操作。

1实验材料

1.1红豆杉细胞 未经MJ诱导处理的A<1>和经MJ诱导处理的B<1>红豆杉细胞。

1.2寡核苷酸引物

(1)3’锚定引物:

①H-T11A(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’
      ②H-T11C(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’
      ③H-T11G(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’

(2)5’ 随机引物:

Kit引物:

①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ 
      ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ 
      ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ 
      ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ 
      ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ 
      ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ 
      ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ 
      ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTTACCGC-3’

生工引物:

①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’ 
      ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’ 
      ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’ 
      ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’ 
      ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’ 
      ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’ 
      ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’ 
      ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’

特异引物:

①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’ 
      ②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’ 
      ③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’ 
      ④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’ 
      ⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’ 
      ⑥3ben:5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’ 
      ⑦Phen:5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’

1.3主要试剂

(1)RNA提取

柠檬酸钠(Sodum citrate),十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine),巯基乙醇(β-mercaptoethanol),异硫氰酸胍(guanidine isothiocyanate), 焦碳酸二乙酯(DEPC),水饱和酚等购自上海生工生物工程有限公司。

(2)逆转录及PCR扩增

SuperscriptTMⅡ试剂盒(Cat No:18064-022,Invitrogen公司),GIBCO BRL公司;RNAimage试剂盒,GenHunter公司;Taq DNA聚合酶和dNTPs,华美生物工程公司;寡核苷酸引物,上海生工生物工程公司合成;其它试剂均为国产分析纯产品。

(3)PAGE凝胶检测

100bp DNA ladder(Cat No:MG0911), 华美生物工程公司;丙烯酰胺,甲叉丙烯酰胺,BIOMOL公司;其它试剂均为国产分析纯产品。

1.4主要仪器

PTC-100基因扩增仪(Techne公司,英国),GeneGenius 凝胶成像系统(SYNGENE公司,美国)。-70℃超低温冰箱(Thermo Forma,美国),PCR超净台(基因有限公司,美国),DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂), 5810R低温冷冻离心机(Eppendorf,德国),Micro-MB3616型高速离心机(IEC公司,美国),Vortex GENIE2(基因有限公司,美国),GeneQuant核酸定量仪(Pharmacia Biotech 公司,英国)。CS101-2A电热鼓风干燥箱(银河,中国重庆),DYY-111 12型三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂),DYY-111 20A型DNA序列分析电泳槽(北京六一仪器厂),TY-80A脱色摇床(北京六一仪器厂)。

2 实验方法

2.1 总RNA的提取与检测

(1)用品的准备

塑料器皿,如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌并烘干后使用;所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌后4℃保存;玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上,冷却备用。

(2)试剂的配置

① CSB缓冲液 
     42mmol/L柠檬酸钠(Sodum citrate) 
     0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine) 
     0.2mmol/L巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)

(3)RNA提取

对悬浮培养细胞A<1>、B<1>进行RNA提取,提取步骤如下:

① 50ml离心管中加入10ml变性匀浆液,冰浴5分钟。 
     ② 取0.5g细胞在液氮中研磨至粉末,转移至预冷的变性匀浆液中,加200ulβ巯基乙醇,振荡混匀。 
     ③迅速加入1ml 2mol/L乙酸钠(PH4.0),充分混合。 
     ④  加入10ml水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。 
     ⑤ 加入2ml氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟。 
     ⑥ 4℃,12,000g,离心20分钟。 
     ⑦ 小心移取上层水相,弃去中间相和下层有机相。 
     ⑧ 加入6ml水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。 
     ⑨ 加入6ml氯仿:异戊醇(24:1), 剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟。

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