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DNA片段的纯化回收

标签: DNA片段 纯化回收

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载体及目的DNA 片断经酶切后,如果无多余的片断(如载体单切)可以直接酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收直接连接用。但多数还有多余片断(如载体双酶切后有插入片断但要回收空载体,多个目的DNA片断选择其一克隆),必须电泳分离后回收目的片断。回收的方法既有传统的方法,这些方法基于降低凝胶的熔点以释放DNA,然后通过酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收,也有公司生产的商品化的试剂盒可用,这些试剂盒多采用凝胶裂解液(如含有降低熔点的NaI)融化凝胶释放DNA后,采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后,用洗液洗去杂质,最后用洗脱液洗出DNA。

一.材料、试剂和仪器:

1 材料:待回收DNA样品

2试剂:

1) 1% 低熔点胶,琼脂糖。

2) glassmilk kit: 裂解缓冲液,漂洗液,glassmilk。

3) TE, ddH2O。

4) 酚/ 氯仿, 氯仿, 无水乙醇,70%乙醇。

5) DNA回收试剂盒: 树脂, 80%异丙醇,Syringe Barrel。

3仪器: 离心机, 水浴锅, 电泳仪。

二 实验程序:

2.2.1 低熔点胶法:

1) 电泳到适当位置后在目的DNA条带的前端挖一长方形槽,向槽中加入融化的低熔。

点胶,待凝固后进行电泳。当DNA进入低熔点胶中心时停止电泳。紫外灯下切下目的条带的低熔点胶。

2) 将切下的胶放到离心管中,加入200μl的TE,65℃温浴3min以融化低熔点胶。

3) 分别用酚/氯仿,氯仿抽提一次。

4) 取上清,加入2倍体积的无水乙醇,-20℃沉淀DNA 2hr以上,12 000rpm离心15min,弃上清,用70%乙醇洗涤,吹干后溶于10μl无菌水中,取1μl电泳检测。

2.2.2. 冻融法:

1) 电泳后直接切下凝胶中目的条带后加200μl TE,再加2倍体积酚,在液氮中冻2min ,再65℃水浴中融化10min,这样重复数次。

2) 10 000g离心5 min,取上相液加2倍体积100%冰乙醇-20℃沉淀过夜。

3) 离心回收DNA,70%乙醇洗一次后溶于适量的TE或无菌水中,电泳检测回收效果。

2.2.3 Glassmilk法:

2.2.4. 试剂盒法(Technical bμlletin of Wizard PCR Preps DNA Purification system Promaga公司):

1) 电泳分离PCR产物。

2) 用干净无菌的刀片切割目的DNA条带,放入1.5mL Ep管中,积累凝胶至大约300μl。

3) 在装有凝胶的离心管中加入1mL树脂, 65℃水浴5min或直到凝胶完全溶解。

4) 拔出注射器活塞备用,将 Syringe Barrel和Minicolumn 连接。

5) 将树脂DNA混合液移入Syringe Barrel中,插入活塞缓慢将混合液推入Minicolumn。

6) 分开syringe Barrel和Minicolumn ,去掉活塞。重新连接Syrringe Barrel和Minicolumn, 加入2mL 80%异丙醇到Syringe中以洗柱子。插入活塞,缓慢将异丙醇推入Minicolumn。

7) 去掉Syringe,将Minicolumn移入1.5mL离心管中,10 000g(半径5.5~6cm13000rpm)离心2min以干燥树脂。

8) 将Minicolumn放入一新的离心管中,加入50μl ddH2O或TE到Minicolumn中,放置1min,10000g,离心20sec。

9) 去除Minicolumn,将纯化的DNA贮存于4℃或-20℃。

二.结果分析:

DNA纯化回收后, 电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带, 那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带。这时可以进行重复纯化回收。

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