BAC提取前准备（前两天 ）

配制含25 mg/l Kan的LB培养基选择平板，在超净工作台上用接种环从购买的BAC划线接种至选择平板，于37℃培养箱培养过夜，供选择单。

BAC提取前准备（前一天）

1、在超净工作台上，用50 µg/ml Kan和液体LB培养基配制成25 mg/l Kan培养基，每个Falcon试管分装10 ml。也可先分装10 ml无抗生素的液体LB培养基后，然后每管中加5 µl浓度为50 µg/ml Kan溶液。

2、在培养皿中标出三个单克隆 （不要太大，不要太小），用牙签挑取第1个单克隆 一半，在的的小培养皿固体LB培养基（分装10 ml，含25 mg/l Kan）上划一横线，标上序号；接着用同一根牙签挑取第1个单克隆 的另一半接种到刚配制好的液体培养基中。第2、3个单分别用牙签挑取在同一个小培养皿固体LB培养基上划一横线，分别标上序号。

3、接种的固体培养基置于37℃培养箱过夜。接种到Falcon试管中的E.coli 进行液体振荡培养（37℃，240 rpm）20小时。

BAC提取（第二天）

将缓冲液P1按要求加入RNase A，置于冰上。缓冲液P3也置于冰上。取出适量缓冲液QF在65℃条件下预热。其他缓冲液在常温下保存。

1、接种的固体培养基从37℃培养箱中取出，用包装膜封好后置于4℃条件下贮存。取液体振荡培养的Falcon试管到超净工作台中，在微量离心管中分装300 µl的E.coli 和300 µl 30%glycerol的LB培养基，用移液器上下吹吸混匀，置于-80℃贮存。

2、将Falcon试管在室温条件下2700 rpm离心20 min。丢弃上清，将沉淀置于冰上。

3、在0.6 ml缓冲液P1中重悬细菌沉沉小球。边吹吸边搅动，混匀而不要出块菌块，然后全部转移到2 ml 微量离心管中。

4、加入0.6 ml缓冲液P2，上下倒置数次，轻轻混和，在室温下培养5 min。

5、加入0.6ml冰冷的缓冲液P3，立即上下倒置数次，轻轻混和，在冰上培养5 min。

6、用微量离心器在最大速度下（13000 rpm）离心10 min。此时可支起过滤架，标好QIAGEN-tip 20尖管。

7、利用1 ml缓冲液QBT对QIAGEN-tip 20尖管进行平衡处理，让其在重力作用下从柱中流出。

8、将离心后的上清倒入QIAGEN-tip 20尖管，让其在重力作用下进入树脂。

9、用4 ml缓冲液QC对QIAGEN-tip 20尖管进行清洗2次，每次用2 ml。

10、清洗后将1.5 ml或2 ml微量离心管置于QIAGEN-tip 20尖管头下，用0.8 ml预热的缓冲液QF分两次稀释DNA 。每次0.4 ml。

11、用0.7体积（每0.8 ml稀释体积用0.56 ml）的isopeopanol在室温下沉淀DNA 。立即用微量离心机中在13000 rpm 转速下离心30 min。此步以后在离心机上操作要注意离心管的放置方向，保持沉淀方向一致或作好标记。以利于用移液管移吸上清，不会搅动沉淀。另外，抽吸剩下少量（约50 ml）溶液可再离心一次，之后全部吸出上清。

12、用1 ml 70%酒精加入微量离心管中（洗涤DNA ），在13000 rpm 转速下离心5 min。先用移液器从沉淀小球对面移去大部分酒精，抽吸剩下少量（约50 ml）溶液再置于13000 rpm 转速下离心5 min。然后移出酒精，在通风处或超净工作台送风条件下风干，但不宜过干，过干很很难溶解。

13、用20 µl TE缓冲液（pH 8）溶解DNA ，置于冰上，每10 min 弹击微量离心管，以促进DNA 溶解。之于置于4℃条件下过夜。

14、第三天可将DNA 取出，在60℃条件下预热一小时，每10 min 弹击微量离心管，以促进DNA 溶解。之后在1%的琼脂糖胶上鉴定。