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BAC提取方法

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BAC提取前准备(前两天 )

配制含25 mg/l Kan的LB培养基选择平板,在超净工作台上用接种环从购买的BAC划线接种至选择平板,于37℃培养箱培养过夜,供选择单。

BAC提取前准备(前一天)

1、在超净工作台上,用50 µg/ml Kan和液体LB培养基配制成25 mg/l Kan培养基,每个Falcon试管分装10 ml。也可先分装10 ml无抗生素的液体LB培养基后,然后每管中加5 µl浓度为50 µg/ml Kan溶液。

2、在培养皿中标出三个单克隆 (不要太大,不要太小),用牙签挑取第1个单克隆 一半,在的的小培养皿固体LB培养基(分装10 ml,含25 mg/l Kan)上划一横线,标上序号;接着用同一根牙签挑取第1个单克隆 的另一半接种到刚配制好的液体培养基中。第2、3个单分别用牙签挑取在同一个小培养皿固体LB培养基上划一横线,分别标上序号。

3、接种的固体培养基置于37℃培养箱过夜。接种到Falcon试管中的E.coli 进行液体振荡培养(37℃,240 rpm)20小时。

BAC提取(第二天)

将缓冲液P1按要求加入RNase A,置于冰上。缓冲液P3也置于冰上。取出适量缓冲液QF在65℃条件下预热。其他缓冲液在常温下保存。

1、接种的固体培养基从37℃培养箱中取出,用包装膜封好后置于4℃条件下贮存。取液体振荡培养的Falcon试管到超净工作台中,在微量离心管中分装300 µl的E.coli 和300 µl 30%glycerol的LB培养基,用移液器上下吹吸混匀,置于-80℃贮存。

2、将Falcon试管在室温条件下2700 rpm离心20 min。丢弃上清,将沉淀置于冰上。

3、在0.6 ml缓冲液P1中重悬细菌沉沉小球。边吹吸边搅动,混匀而不要出块菌块,然后全部转移到2 ml 微量离心管中。

4、加入0.6 ml缓冲液P2,上下倒置数次,轻轻混和,在室温下培养5 min。

5、加入0.6ml冰冷的缓冲液P3,立即上下倒置数次,轻轻混和,在冰上培养5 min。

6、用微量离心器在最大速度下(13000 rpm)离心10 min。此时可支起过滤架,标好QIAGEN-tip 20尖管。

7、利用1 ml缓冲液QBT对QIAGEN-tip 20尖管进行平衡处理,让其在重力作用下从柱中流出。

8、将离心后的上清倒入QIAGEN-tip 20尖管,让其在重力作用下进入树脂。

9、用4 ml缓冲液QC对QIAGEN-tip 20尖管进行清洗2次,每次用2 ml。

10、清洗后将1.5 ml或2 ml微量离心管置于QIAGEN-tip 20尖管头下,用0.8 ml预热的缓冲液QF分两次稀释DNA 。每次0.4 ml。

11、用0.7体积(每0.8 ml稀释体积用0.56 ml)的isopeopanol在室温下沉淀DNA 。立即用微量离心机中在13000 rpm 转速下离心30 min。此步以后在离心机上操作要注意离心管的放置方向,保持沉淀方向一致或作好标记。以利于用移液管移吸上清,不会搅动沉淀。另外,抽吸剩下少量(约50 ml)溶液可再离心一次,之后全部吸出上清。

12、用1 ml 70%酒精加入微量离心管中(洗涤DNA ),在13000 rpm 转速下离心5 min。先用移液器从沉淀小球对面移去大部分酒精,抽吸剩下少量(约50 ml)溶液再置于13000 rpm 转速下离心5 min。然后移出酒精,在通风处或超净工作台送风条件下风干,但不宜过干,过干很很难溶解。

13、用20 µl TE缓冲液(pH 8)溶解DNA ,置于冰上,每10 min 弹击微量离心管,以促进DNA 溶解。之于置于4℃条件下过夜。

14、第三天可将DNA 取出,在60℃条件下预热一小时,每10 min 弹击微量离心管,以促进DNA 溶解。之后在1%的琼脂糖胶上鉴定。

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