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基因组DNA的提取

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第一节 概 述

DNA的提取通常用于构建文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物(植物、动物、微生物)的DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。

本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习DNA提取的一般方法。

第二节 从植物组织提取DNA

一、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。

二、设备

移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。

三、试剂

1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris·Cl,pH8.0,20mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,1.5% SDS。

2、提取缓冲液Ⅱ:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240μl巯基乙醇,加水至300ml。

3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4、RnaseA母液:配方见第一章。

5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步骤:

(一)水稻幼苗或其它禾木科植物DNA提取

1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,60℃水浴预热。

2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4.室温下5000rpm离心5分钟。

5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。

8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。

9.加入5μl RNaseA(10μg/μl),37℃ 10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。

10.加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12.将DNA重溶解于1ml TE,-20贮存。

13.取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。

[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA,足供RFLP、PCR等分析之用。

(二).从李(苹果)叶子提取DNA

1.取3-5克嫩叶,液氮磨成粉状。

2.加入提取缓冲液Ⅱ10ml,再研磨至溶浆状。10000rpm,10min。

3.去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml,混匀。65℃,30-60min,常摇动。

4.同本节(一)中步骤3-13操作。

第三节 从动物组织提取DNA

一、材料

哺乳动物新鲜组织。

二、设备

移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。

三、试剂

1、分离缓冲液:10mmol/L Tris·Cl pH7.4,10mmol/L NaCl,25mmol/L EDTA。

2、其它试剂:10% SDS,蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂),乙醚,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇及70%乙醇,5mol/L NaCl,3mol/L NaAc,TE。

四、操作步骤:

1.切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。

2.倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。

3.加1ml 10% SDS,混匀,此时样品变得很粘稠。

4.加50μl或1mg 蛋白酶 K,37℃保温1-2小时,直到组织完全解体。

5.加1ml 5mol/L NaCl,混匀,5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管,用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。

7.取上层水相至干净离心管,加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8.移去上层乙醚,保留下层水相。

9.加1/10 体积3mol/L NaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。

10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl),37℃保温30分钟,用酚抽提后,按步骤9-10重沉淀DNA。

第四节 细菌DNA的制备

一、材料

细菌培养物。

二、设备

移液管,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅。

三、试剂

1、CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2、其它试剂:氯仿:异戊醇(24:1),酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),异丙醇,70% 乙醇,TE,10% SDS,蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂),5mol/L NaCl。

四、操作步骤:

1.100ml 细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。

2.加9.5ml TE悬浮沉淀,并加0.5ml 10% SDS,50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K,混匀,37℃保温1小时。

3.加1.5ml 5mol/L NaCl,混匀。

4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。

5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。

6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中。

7.加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟,沉淀DNA。

8.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1ml TE,-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀。

9.如要除去其中的RNA,可以按本章第三节中操作步骤处理。

第五节 DNA的检测

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得DNA后,均需检测DNA的产量和质量。

1.DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值,明确DNA的含量和质量。

2.取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。

3.取2μg DNA,用10单位(U)HindⅢ酶切过夜,0.7% agarose胶上电泳,检测能否完全酶解(做RFLP,DNA必须完全酶解)。

如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA多,影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理:

(1)选用幼嫩植物组织,可减少淀粉类的含量。

(2)酚:氯仿抽提,去除蛋白质和多糖。

(3)Sepharose柱过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA。

(4)CsCl梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA(可用作文库构建)。

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