本法[根据Godson和Vapnek(1973)的方法修订而成]的产量要低得多,但却比本章所述的其他方法更温和,是提取大质粒(大于15kb)的首选方法。 试验步骤: 1、将500ml细菌沉淀物洗过后重悬于10ml用冰预冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中,将悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管[橡树岭(Oak Ridge)型]中。 2、加入2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时,溶菌酶不能有效地发挥作用。 3、加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0),将管倒置数次以混匀悬液,在冰上放置10min。 4、加4ml 10% SDS,用玻棒迅速混匀内容物,使SDS均匀分散到整个细菌悬液中,操作应尽可能温和小心,以便最大限度地避免释放出来的DNA受到剪切。 5、立即加入6ml 5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L),再次用玻棒温和彻底地混匀内容物,在冰上放置至少1h。 6、以4℃【用Beckman Ti50型转头(或与其相当的转头)】,30 000rpm离心30min,小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中,弃去沉淀物。如果细菌碎片未能全部除尽,可用35 000rpm再离心20min,将上清转移到另一管中,去掉存在离心管内的粘稠状液体。 7、上清分别用酚/氯仿和氯仿各抽提1次。 8、将水相转移到250ml的离心瓶中,于室温加入2倍体积的(约60ml )乙醇,充分混匀,室温下放置1-2h。 9、以4℃,5000rpm离心20min,回收核酸。 10、离心管倒置于纸巾上,使最后残存的乙醇流干,在真空干燥内短时间干燥沉淀物,但不要使之完全干燥。 11、用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。 |
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