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DNA连接技术

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[原理]

利用DNA 连接酶把载体 DNA 和要克隆的目的 DNA 片段连接在一起,成为一个完整的重组分子,这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体 DNA 和外源 DNA 末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话(同尾酶也可以),或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴,那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源 DNA 两端的限制性内切酶切点 ,从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNa段。

[操作]

(1 )取 3 支 eppendorf 离心管,标上 1 、2 、3 号。

(2 )按下 表依次加水、V-DNA ,在 2 ,3 号管加 P-DNA 。

                               连接反应各管加样情况

 

管号       V-DNA         P-DNA          ddH2 O        10 × Buffer     T4连接酶 

 

           (μl)         (μl)          (μl)                      (0.2μ/ml)  

 

1            1                            7              1              1

 

2            1              8              1      

 

3            1             5              2              1              1

 

 (3 )离心 3 秒,置 65 ℃保温 10 分钟,然后取出插入冰中。

(4 )用 T4 DNA 连接酶稀释液把 T4 DNA 连接酶稀释至 0.2 U / ml 。

(5 )按表中所示的量加入 10 ×缓冲液,在 1 及 3 中加连接酶。

(6 )混匀,离心3 秒钟,置 12 ℃恒温水浴过夜。次日取出,如不做转染放 -20 ℃保存。2 和 1 为对照,以检查 V-DNA 的酶切效果和连接酶连接效果。

现在宝灵曼公司已推出快速连结 DNA 试剂盒。该试剂盒能在室温下 5 分钟内将粘性末端或平头末端片段连接。进行反应需要的所有试剂已包括在试剂盒内。

[试剂与器材]

l .试剂

(l )载体 DNA(V-DNA): M12 mp19RF DNA ,经 BamHI 切割 ,分子量约 7.2kb ,浓度约 lμl =10 ng 。

(2 )外源 DNA(P-DNA): AcNPV 变株 m29DNA 的 BamHI 切割产生的 F 片段,分子量约 1.9 kb ,浓度 1μl=5ng 。

(3 )10 ×连接反应液: 700 mmol / L Tris-HCl ,pH7.5 ,70mmol / L MgCl2 ,0.7mmol / L ATP 。

(4 )T4 DNA 连接酶稀释液: 50mmol / L Tris-Cl ,pH7.5 ,500μg/ml BSA (牛血清白蛋白)。

2.器材 恒温水浴器。

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