1.感受态的制备 (1)接种单菌落于2ml LB培养液中,37℃过夜。 (2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中,37℃振摇4~6h至A590=0.4~0.6。 (3)倒入50ml管内,水浴10min,以2500~3000rpm离心5min,弃上清。 (4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体,冰浴20min,同上离心弃上清。 (5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。 2.重组DNA的转化 (1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记: (2)冰浴30min至1h。中间摇动3次,以防受体菌沉底。 (3)42℃90s。 (4)37℃水浴5min。 (5)加入无相应抗生素的Lb 200μl,混匀后,37℃水浴30~60min。 (6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。 |
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