操作步骤: 1.取15ml研磨器,加入5ml血块,4-5ml溶血试剂,研磨至无凝块存在。转移到50ml离心管中,2500rpm,10min。 2.去上清,假溶血试剂清洗一遍,2500rpm,10min,至无红色存在。 3.去上清,加1ml细胞裂解液,转移到离心管,加20mg/ml蛋白酶K 10ml,56℃水浴,3小时。 5.重复步骤4。 6.取上清于2mlEP管,加等体积氯仿/异丙醇,混匀,6000rpm,10min。 7.取上清于另一2mlEP管,加NaAc,混匀,加等体积的异丙醇,混匀,可见白色沉淀,10000rpm,5min。 8.去上清,加0.3ml无水乙醇,10000rpm,5min,去酒精,风干。 9.加TE液,水浴至DNA溶解,测DNA浓度。 注意事项: 1.观察酚的颜色,一般为黄色,如果变成粉红色,说明被氧化,不能再用。 2.酚有强腐蚀性,易引起烧伤,一旦皮肤沾染上,应用清水冲洗,用肥皂或稀释的苏打水洗涤,切记不用酒精擦洗。 3.溶血试剂,细胞裂解液,TE液需要高温高压消毒。 4.核酸因含有共轭的苯环而吸收紫外光,DNA和RNA的最大紫外光吸收波长为260nm。 5.260nm光吸收值为1时(A260=1),dsDNA的质量浓度相当于50ug/ml,则dsDNA的浓度为: A260 值× 50ug/ml ×稀释倍数。 6.纯度: A260 /A280表示,如果纯的dsDNA的值约为1.8,如果大于1.8,则说明有RNA的污染,如果小于1.8,则说明样品中有蛋白质或饱和酚的污染。 7.提取的DNA应该完全溶解后再测其浓度,而且在测浓度的时候,一定要把稀释的样品混匀,不然测得的结果会有大的偏差。 |
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