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质粒的大量提取之细菌的培养及收集

标签: 质粒 提取 细菌

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在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。

许多年来,一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效,然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中,采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA,而且重复性也很好。

1、 将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(OD600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素,用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。

2、 将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37℃)加入25ml对数晚期的培养物,于37℃剧烈振摇培养2.5h(摇床转速300转/分),所得培养物的OD600值约为0.4。

3、 可做可不做:加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇), 使终浓度为170μg/ml。有些质粒只要生长达到,新一代的质粒(如pUC质粒)可复制到很高的拷贝数,因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复制质粒,有必要扩增。用氯霉素进行处理,具有抑制细菌复制的优点,可减少细菌裂解物的体积和粘稠度,极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来,尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便,但用氯霉素处理还是利大于弊。

4、 于37℃剧烈振摇(300转/分),继续培养12-16小时。

5、 用Sorvall GS3转头(或相当的转头)于4℃以4000rpm离心15min,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。【STE:0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L E DTA(pH8.0) 5% Triton X-100】按照前面所述收集细菌细胞。

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