近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。一般来讲,基因克隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆的基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。

一、抗病基因克隆的方法

（一）功能克隆

功能克隆即已知基因编码产物的克隆方法。当目的基因序列未知,但其编码产物的生理生化及代谢途径研究得比较清楚时,就可以采用这种克隆方法。功能克隆根据克隆基因的原理又可分为两条路线,一条是分离纯化已知的蛋白质或多肽,制备该蛋白的特异抗体,利用标记的特异蛋白抗体作为探针筛选由表达型载体建立的基因组文库或者cDNA文库,通过免疫杂交筛选到重组克隆,并最终克隆目的基因;第二条路线是将蛋白质纯化后测定其N 端一段氨基酸序列,根据蛋白质密码子编码规律和密码子偏爱原则,反向推算出mRNA序列,然后据此人工合成一段寡核苷酸作探针,利用同位素或其它方法标记后筛选一般的基因组文库或cDNA 文库,筛选阳性重组克隆,并最终克隆目的基因。

随着植物抗病反应的深入研究及蛋白质分离纯化技术的发展,相信功能克隆的策略会发挥重要作用,但一部分抗病基因的产物及表达调控特性尚不清楚,因此在一定程度上也限制了该策略的应用。

（二） 定位克隆

定位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,目标基因精确定位在染色体特定位置之后,用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大的插入片段的基因组文库(如BAC和YAC) ,通过染色体步行筛选到含有目标基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。其核心任务是染色体步行,如果能找到与目标基因很近的标记,以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小,就可以直接筛选到含有目标基因的克隆,最终得到候选基因,这种策略称为染色体登陆。

到目前为止,利用定位克隆策略,单基因性状相关基因的鉴定方法已较完善且取得了一个系列成果,已使几十种重要的基因得到了分离。但定位克隆技术需要寻找与目标基因座位连锁的遗传标记或部分功能信息。有时需连锁作图,较费时费力。而且在植物的基因组中,大量存在DNA 重复序列经常是染色体步移难以逾越的障碍。

（三） 序列克隆

序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列时采用的方法。这种情况下,可以从DNA 序列数据库(如GenBank 数据库) 中查找有关基因的序列,然后可以设计并合成一对寡核苷酸引物,提取所要分离基因的植物染色体DNA 或者用RNA 在逆转录酶的作用下合成cDNA 的第一条链,以此为模板,采取PCR 或RT-PCR 的方法来克隆基因。扩增的片段经纯化后,连接到合适的载体上,经酶切和序列分析并与已知的基因序列作比较。

此方法简便快速,国内利用此方法已经克隆了豌豆外源凝集素基因。有时要从其他的种、属中克隆同源基因时,可以先比较序列已知的基因序列,寻找比较保守的区域,根据此区域的序列设计并合成探针,然后从cDNA 文库或者基因组文库中筛选到目的基因的克隆。如利用酵母菌乙酰乳酸合成酶的基因序列,已从烟草和拟南芥中克隆出抗除草剂的乙酰乳酸合成酶基因。Payne G. 等根据烟草中酸性几丁质酶和碱性几丁质酶的氨基酸序列C 端的同源率为65 % ,以已知的碱性几丁质酶的核酸序列为探针,从烟草的cDNA 文库中筛选了两种酸性几丁质酶的基因PR-P 和PR-Q。

（四） 表型克隆

表型克隆是与定位克隆相对的一种克隆基因的策略,它是对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆。1995 年Weissman 在前人的工作基础上首先提出了表型克隆的概念,由于它能较好地解决定位克隆策略所遇到的困难,因此被称作是分子遗传学观念上的一次革新。它可对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆分析并分离该基因,而不必事先知道其生化功能及在染色体上的精确位置,也不需知道假设基因的数目或其作用方式,将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来从而分离特定表型相关基因。表型克隆与定位克隆相比,省去了用大量遗传标记进行定位分析的繁琐程序,可较容易地检测基因组之间差异或相同区域,大大加快基因克隆的速度。

二、应用较多的几项技术

（一）鸟枪克隆法（Shotgun Cloning）

该方法是随机切割供体基因组DNA ,再转化到受体基因组中,根据对转化子的表型鉴定,然后找出所需克隆的基因,鸟枪克隆战略成功地应用于分离细菌的无毒基因。Staskawica B. J . 等利用这一策略,从大豆病原菌Pseudomonas Syringae pv.Glycinea中克隆到了它的无毒基因。但是在高等植物中,由于基因组很大,因而应用这种方法克隆基因非常困难。例如,如果将此方法应用于番茄的抗病基因筛选,需要以双元载体构建抗病品种的基因文库,然后通过农杆菌等将它们导入感病品种之中,然后筛选抗病转化体来分离抗病基因。但这样鉴定一个单拷贝的基因,需要筛选105株转基因植株,工作量非常大。

(二) 消减杂交法（Subtractive Hybridization）

消减杂交法是利用DNA复性动力学来富集一个样品中有，而另一个样品没有的DNA。消减杂交可以是cDNA 。用来寻找两样品中差异的基因，也可以是基因组DNA，用于样品中特异存在的基因。其方法是将过量的driver DNA和样品中的目的DNA退火，然后复性，样品中的共同序列形成双链，而目的DNA序列大多数为单链。用羟基磷灰石柱或者生物素标记结合等方法不断除去双链DNA序列。经过多轮变性和复性，样品中的特异性目的DNA序列得以富集，或者用PCR进行体外扩增。通过遗传学分析验证富集的克隆DNA。负性杂交法比其他基因克隆法省时省力。但目前还不能用于复杂的基因组植物的抗病基因克隆。

（三）转座子标签法（Transposon Tagging）

就植物抗性基因的克隆工作来讲,转座子标签技术( Transposon Tagging) 可能是应用最为普遍的一种方法。它是利用转座子来克隆基因的技术,其显著特点是可以分离预先不清楚表达产物的基因。其基本原理是:当转座子插入到植物基因组中某个基因或者基因的邻近位点时,会破坏该基因的结构,引起基因突变使植物表型发生变异,因此可以用转座子作为探针从被标记的突变体植物的基因文库中,克隆出突变的基因,然后再利用突变基因作为探针从野生型植物中克隆出野生型基因。

（四）图位克隆法(Map - based cloning)

图位克隆法是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,在目标基因精确定位到染色体的特定位置以后,运用与目标基因紧密连锁的分子标记筛选含有目标基因的大片段基因组文库(BAC或YAC) ,再通过染色体步行筛选到含有目标基因的亚克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。图位克隆法是以高密度的分子标记图谱为基础,其关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记,核心任务是染色体步行。但是对于基因组较大,重复序列较多的一些植物,采用该方法分离克隆抗病基因不仅投资大而且效率低,因此,该方法也受到一定的限制。

除了上面介绍的几种技术，在植物抗病基因克隆工作上还会用到的有: DNA 转染法(DNA Transfection) 、代表性差异分析技术(Representational Difference Analysis) 、mRNA 差异显示(mRNA Differential Display) 、抑制消减杂交法(Suppression Subt ractive Hybridization)、产物导向法、插入诱变法、作图克隆法等。