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PCR剪接VHCDR3基因文库和VL基因构建scFv基因文库

标签: PCR剪接 VHCDR3基因文库 VL基因 scFv基因文库

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[器材和试剂]

Winard PCR纯化试剂盒  (Promega)

PCR试剂和设备

用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌TGl株的试剂和设备  FDSEQ引物

扩增的VHCDR3基因文库和VL基因,

[方法]

1. 配制4个25ulPCR反应液,包含:

去离子水,10.25ul

10×Vent缓冲液,2.5ul

20×dNTP(每种5mmol/L),  1.25ul

VH文库DNA(200ng),l 0ul

VL基因DNA(200ng),  5.0ul

VentDNA聚合酶(2单位),1.0ul

在有加热盖PCR仪中以94℃1.5分钟、65℃1.5分针、72℃1,5分钟无扩增循环7次,连接片段。

2. 7次循环后,保持在94℃,添加含有旁侧引物的25ul混合液:

去离子水,15.2ul

10×Vent缓冲液,2.5ul

20×dNTP(每种5mmol/L),  1.3ul

FdSEQ引物  (10pmol/u1),  2.5ul

LMB3引物(10pmmol/ul),2.5ul

VentDNA聚合酶(2单位),1.0ul

3. 以94℃1分钟、42℃1分钟、72℃2分钟的条件共循环30次,剪接片段。用Wlnard  PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。

4. 用NcoI和NotI消化PCR产物。

5. 将消化的PCR产物连接到NcoI/NotI消化的pHENl中,并电转化到大肠杆菌TGl细胞,用于VHCDR3多样化的引物定位和设计。

VHCDR3多样化所需引物是根据拟亲和力成熟抗体的V基因序列进行设计的。例中,VHCDR3(下划线区域)中7个氨甚酸被随机化。框架3 (FR3)末端和框架4(FR4)起始端用实线标出

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