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分子标记常见问题及其对策

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1.显性标记与选择效率

一部分分子标记系统如RAPD、AFLP具有显性或部分显性的特点,无法区分基因是纯合还是杂合,不能提供完整的遗传信息。Haley等(1994)提出相斥相(Repulsion-phase)的RAPD标记无论对显性还是隐性均可极大地提高选择效率,他们找到了和菜豆普通花叶病毒抗性基因bc-3连锁相引标记-1,相斥标记bc-2,用标记-1选择纯合抗病株、杂合体、纯合感病株分别占26.3%,72.5%和1.2%,用标记-2选择分别占81.8%,18.2%和0,当两个标记同时使用时,即相当于一个共显性标记,与标记2的选择效率相同。这种方法解决了MAS中,显性标记不能区分纯合、杂合基因型的缺陷。

2.基因型限制

最有价值的标记是在广泛的基因背景下都能表表达,并能检测出来的标记。然而,目的基因与标记的连锁距离因遗传背景的不同而存在差异。标记与目的基因的遗传距离是影响辅助选择效率的一个重要因素。菜豆上,来源于Andean的抗性基因的RAPD标记在Middle America的遗传背景下表现紧密连锁,反之也成立。但在供体遗传背景下,RAPD标记就失去了选择能力。Andean中OA141100不能用来选择UP-2基因,OA141100标记的应用被局限在Middle America内。RAPD标记连锁距离的差异,影响了在不同遗传背景下的选择效果,寻找无重组的RAPD标记或将RAPD标记转化为RFLP标记,可以解决这个问题。

3.标记的稳定性和可操作性

常用分子标记技术在基因标记等方面发挥了巨大作用,却存在一些缺点,如RFLP、AFLP等,成本高,操作繁琐,周期长,又有放射性污染,不适合于大样本选择。RAPD虽无上述缺点,但却存在稳定性差的弊端,将它们转化为特异性扩增子多态性(Specific Amplificon Polymorphism,SAP)或称目标性状位点(Sequence Tagged Sites,STS)可以解决这些缺点。主要包括以下两种:1)酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,CAP)对RFLP探针的两端测序 ,合成22引物进行PCR扩增,扩增产物往往无多态性,需用内切酶酶解产物,产生多态性。2)序列特异性扩增区(Sequence-characterized Amplified Region,SCAR),对RAPD片段两端测序 ,根据所测DNA 序列,合成24bp双引物进行PCR扩增。SCAR、CAP可以降低成本,操作简便,稳定性强,对仪器要求低,适合于大样本、快速分析。

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