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肠杆菌电转化感受态细胞制备经验过程

标签: 肠杆菌 受态细胞

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实验步骤:

1、将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37℃下过夜培养 。

2、高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)。准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用 。

3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板摇瓶中 。

4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。

5、定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) ,当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)。

6、细胞在4℃ 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4℃的10%甘油中保存一两天)。

7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。

8、照上面步骤重复离心,小心弃去上清液。

9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 。

10、离心,弃上清液 。 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)。

11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。

12、将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80℃保存。

转化方法:

1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 。

2、添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟。

3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中。

4、加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT 。

5、对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数,应该在3以上)。

6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。

7、37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原 。

8、转移细胞至适当的选择培养基上培养 。

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