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质粒大量提取之煮沸裂解法

标签: 质粒 提取 煮沸裂解法

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该法[根据Holmes和Quigley(1981)的方法修订而成] 可与随后的纯化步骤如氯化钯-溴化乙锭梯度平衡离心等步骤联合使用。建议该法只用于经氯霉素处理的培养物,未处理的培养裂解后过于粘稠,不利于操作。当从大肠杆菌HB101或其衍生质粒(包括TG1)中大量提取质粒时,不宜采用煮沸法。这些细菌释放大量糖类,在氯化铯-溴化乙锭梯度中与闭环DNA形成密度大致相同的区带。这些糖类还抑制以DNA为模反或底物的酶。

试验步骤:

1、 将500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于用冰预冷的10mlSTET【(0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH 8.0)】中。将悬液移入50ml锥瓶中。

2、 加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉淀于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地发挥作用。

3、 用一个夹子把锥瓶放在酒精灯的明火上加热,直至液体恰好开始沸腾,不停地摇晃锥瓶。

4、 立即把瓶浸入装有沸水的大烧杯(2L)中,将瓶放在沸水中,时间恰为40s。

5、 将瓶浸入用冰预冷的水中5min,使之冷却。

6、 将粘稠状内容物从瓶中转移到超离心管,于4℃以30 000rpm离心30min。原有的细菌物生长得越密,应越难将粘稠状裂解物转移到离心管中。必要时,可用长刀片和剪刀将裂解物剪成大小适于操作的大团块,或抽入10ml注射器的针筒中使之部分剪切。从用氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒DNA时,一般不会出现这样的问题。如果细菌碎片没能形成紧密的团块,可以以35 000rpm再度离心20min, 然后尽可能将上清转移到另一管内,弃去残存在管内的粘稠状液体。

7、 将上清转移到另一管内,纯化质粒DNA。 

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