TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 TRIzol试剂可用于小量样品(50~100mg组织、5×106细胞)也适用于大量样品(≥1g组织、>107细胞)。对人,动物,植物组织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。 注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作)。 RNA的提取 准备试剂:氯仿,异丙醇,75ㄇ乙醇,无RNase的水或0.5ㄇSDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。 操作步骤: 1. 匀浆处理: 2.将匀浆样品在室温(15~30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。 3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2~8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。 5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60ㄇ。 6. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。 |
7. 2~8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 8. 用75ㄇ乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75ㄇ乙醇。2~8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。 9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5~10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25~200μl无RNase的水或0.5ㄇSDS,用枪头吸打几次,55~60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100ㄇ的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。 注意事项: 预期产量:1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为: 常见问题分析: 得率低: A260/A280<1.65 : RNA降解: DNA污染: 蛋白聚糖和多糖污染: |
DNA的分离 准备试剂:乙醇0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇8mM NaOH 操作步骤: 1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2~8℃不超过2000×g离心5分钟。 DNA的定量:取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数,人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。 预期产量:1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3~4μg 骨骼肌,脑组织,胎盘2~3μg 人,大鼠,小鼠培养细胞(1×106)5~7μg 成纤维细胞5~7μg。 应用: 注意事项: |
常见问题分析: 得率低: A260/A280<1.70 : DNA降解: RNA污染: 蛋白质的提取 准备试剂:异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。 操作步骤: 1.取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2~8℃12000×g离心10分钟弃上清。 2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2~8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。 3.真空抽干蛋白质沉淀5~10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃温浴使其完全溶解,不溶物2~8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。 注意事项: 常见问题分析: 得率低: 蛋白质降解:组织取出后没有马上处理或冷冻。 电泳时条带变形:蛋白质沉淀洗涤不充分。 |
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