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DNA 的定量与连接反应

标签: DNA 定量 连接

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药品试剂:

纯化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段

1% 6-well agarose gel

DNA 标准分子量 (λMr, 0.5 μg/μL)

方法步骤:

1) 取4 支微量离心管,依下表加入DNA, TE-8.0 及追踪染剂 (μL):

2) 短暂离心混合后,将各管样品置65℃水浴5~10 min 后,移至冰浴降温后进行电泳分析。

3) 将胶体置于UV transilluminator 上观察各色带的亮度,与已知量的 λMr 比较,找出分别与#3, #4 亮度相当的片段。

4) 估计 #3, #4 的DNA 量及计算每 μL 所含的莫耳数。

纯化的gusA 片段与经BamHI/HindIII 作用的pQE31 片段混合后,末端序列互补的部份会进行黏合,但仍须藉由DNA ligase 催化phosphodiester bond 的形成,将缺口接合起来。

仪器用具:12℃恒温槽

药品试剂:

纯化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段

T4 DNA ligase (1 U/μL, Invitrogen)

5×T4 DNA ligase buffer (0.25 M Tris-HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl2; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% PEG-8000)

方法步骤:

1) 两种DNA 片段于65℃水浴加热10 min 后,置冰浴中。

2) 取5 支微量离心管置冰浴中,依下表所列 (单位 μL) 依序加入各成份:

* Vector 与Insert 的比例为莫耳数比,DNA 总量为100 ng.

3) #1~#4 置于12℃反应过夜,#5 则不加ligase,直接置于4℃冰箱。

4) #1~#4 反应过夜后,以70℃加热10 min,置冰浴中。

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