实验目的:检测病毒滴度 实验原理:根据噬菌斑数计算病毒滴度 材料与试剂: 1、6孔板,12ml离心管,100ml无菌玻璃瓶,无菌吸管,70℃水浴锅,无菌水 2、杆状病毒, SF9:5×105cells/ml 3、4% agarose gel:2g agrose + 50ml 水,高压灭菌 4、2×Grace(unsupplemented):9.14g粉末(invitrogen)+0.07gNaHCO3+H2O,调PH6.1,定容至100ml,无菌过滤 5、supplemented Grace:1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin,3.33mg/ml yeastolate,无菌过滤 6、高温灭活FBS 方法: 1、无菌条件下,2ml/孔细胞(5×105cells/ml)种入6孔板,室温孵育1h使其贴壁,孵育后镜检其贴壁程度 2、将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解,空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热 3、将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释:10-1~10-8
4、弃6孔板内上清,快速加入稀释好的病毒,1ml/孔,复孔,室温孵育1h 6、配置上层琼脂:加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml,25ml 2×Grace(含FBS)+12.5ml 无菌水+12.5ml 4% agarose gel,至预热的100ml无菌瓶,轻轻混匀,放入37℃水浴锅备用 7、弃6孔板内上清,快速加2ml上层琼脂,以防菌层干燥,静置10-20min使其凝固 8、将6孔板放入27℃培养箱,培养4-10天 9、计数板中噬菌斑,直至连续两天无变化,加1mg/ml中性红0.5ml,室温孵育2h后计数噬菌斑 注: 病毒滴度(pfu/ml)=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积 |
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