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标签: 石蜡 组织 DNA 提取 应用

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石蜡包埋组织的DNA提取及其应用

近10年来,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域,为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为,人类基因组并非人们想像的那样稳定,诸如基因重排、扩增、缺失、突变和DNA甲基化类型改变等时有发生,这些改变对于基因表达和调控,以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。

医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法,是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术,本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等(1986)成功地从蜡块中提取出高质量的DNA,完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要,结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史,而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究,对肿瘤发生的分子机制的探讨,诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节 重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。

一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法

从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤,是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等(1985)最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术(表18-5),是用机械的方法破碎组织,切除多余的石蜡,直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K(1mg/ml)的提取缓冲液加温孵育,然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整,但可被限制性内切酶切割,因而适于点杂交,印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等(1986)在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡,保证了组织的完全破碎,使细胞与消化液充分接触,使DNA释放和蛋白去除更加完全;其次通过两步消化的方法,将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除,仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子,从而提高了DNA质量,适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等(1990)对上述两种方法进行了比较,发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致,非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。

Gpelz 氏 DNA 提取方法的主要步骤:

1、切除多余石蜡,暴露组织;
 
2、将组织切碎(最大径 <0.5mm ),称重;

3、溶于 TE9 提取液(组织 <50mg/5ml,50 ~ 500mg/10ml ), 高速混悬 2 ~ 3min;于 48 ℃ 放置 24h,其制备见表 18-6;

4、再次混悬组织,加入蛋白酶 K 至终浓度 1mg/ml,SDS 至 2% ,孵育 40h ;

5、用等体积酚 - 氯仿溶液抽提 3 次;

6、2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA;

7、-70℃ 放置 2 ~ 4h;

8、9000×g 离心 1h;

9、沉淀物用 70% 乙醇洗 1 次;

10、干燥, TE ( pH7.2 )溶解。

TE9 DNA 提取液的制备

Tris

500mmol/L

EDTA

20mmol/L

NaCl

10mmoo/L

SDS

1%

蛋白酶 K

500μg/ml

PH

8.0

实验步骤
 
1、5μm 组织切片;

2、常规脱蜡、水化;

3、第一次溶液 A 孵育(去上清);

4、第二次溶液 A 孵育(留上清);

5、氯仿 - 异戊醇抽提;

6、RNA 酶和蛋白酶消化;
 
7、酚抽提;

8、沉淀;

9、透析(却除未螺旋化 DNA )。

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