一、简介: SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat, 简称SSR标记),也叫微卫星序列重复,是由一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列,长度较短,广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同,造成了SSR长度的高度变异性,由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同,但是其两端序列多是保守的单拷贝序列,因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物,通过PCR技术,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点: (1)标记数量丰富,具有较多的等位变异,广泛分布于各条染色体上; (2)是共显性标记,呈孟德尔遗传; (3)技术重复性好,易于操作,结果可靠。 缺点: 开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息,而且引物合成费用较高。 二、操作程序: 取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记。 1、DNA提取 按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法(`Cetyl triethyl ammonium bromide)并略加改进的程序进行,具体步骤如下: ① 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状,转入1.5ml离心管中,-20℃冰箱保存; ② 加入600μl 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30-60分钟; ③ 取出,冷却,上下摇匀后,加入600微升24:1的氯仿异戊醇; ④ 12000转/分钟离心10分钟,取上清液于另一个1.5ml的离心管中; ⑤ 加异丙醇,12000转/分钟离心10分钟,倒掉上清液; ⑥ 干后用100%的洒精清洗,干后加适量TE。 |
2、PCR扩增 模板DNA的浓度大约25ng/μl,扩增反应体系为20μl。具体如下: Sterile ddH2O 11μl PCR Buffer 3μl dNTP-mix 0.5μl Primer1 1μl Primer2 1μl Taq polymerase 0.5ul(2U/μl) DNA 3μl PCR扩增程序为:(2h30min) ① 预变性:94℃,5分钟; ② 变 性:94℃,40秒; ③ 退 火:55℃ 40秒; ④ 延 伸:72℃,1分钟; ⑤ 循 环:从2到4共38个循环; ⑥ 72℃下最后延伸5分钟;4℃ 5min,扩增产物置于4℃的冰箱保存。 |
3、扩增产物的电泳分离 制胶→灌胶→上样→电泳。 扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离,步骤如下: ① 准备电极液(1×TBE); ② 将梳子拨出,并迅速用电极液冲洗胶面; ③ 不预电泳; ④ 点样,电泳220V; ⑤ 拆板,并及时将内板、边条及梳子洗净。 4、凝胶染色 ① 固定:10%醋酸,5分钟; ② 染色:10分钟; ③ 漂洗:dH2O,5-10秒; ④ 显色:甲醛-NaOH,直到满意为止; ⑤ 漂洗:dH2O,2分钟。 5、自封带封胶,读带标记,数码照相摄像,室温风干。 |
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