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DNA重组实验常见问题分析

标签: DNA重组

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TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些?

参考见解: TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。NEB公司的酶的活性很高,切出两条小带可能是因为出现星活性,可以试试把酶量减半。NEB的酶很多都是克隆的,所以纯度比较高。

应用磁性微球提取人全血基因组DNA,将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应,应用Taq1酶,但发现酶切后产生的是smier片断,即切碎的状态。不知原因是什么?在做这类实验时,一般是将PCR产物进行酶切,这与实验结果有联系吗?是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增,才能应用酶切?

参考见解:

1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.

2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.

3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.

做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。请教该怎么办?

参考见解:回收酶切产物浓度低的原因可能是:苯酚/氯仿抽提时损失太多。说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次,这样经过四次抽提DNA损失得非常多,解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水,然后再抽提,损失会减少很多;另外乙醇沉淀时可以延长,低温沉淀会提高得率;还有用80%乙醇洗涤沉淀弃上清时,要轻轻用移液枪吸出,防止将沉淀随上清倒出。注意这几点应该可以回收到理想浓度的DNA了。

做PCR将分别将50和300bp片段扩出后,将两个片段连接到一起为550bp,要将550bp片段连到载体上,但550bp片段中间产生了新的酶切位点跟设计的酶切位点AseI一样,想通过部分酶切方法得到550的片段,如果完全酶切就分成原来的两个片段,求教部分酶切的详细方法?

参考见解:可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接,之后再进行平化连接,这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间,可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中(比如50微升体系),37度酶切,然后每隔一段时间取出一部分(比如5微升或10微升),然后一起进行核酸电泳,摸索一下合适的酶切时间。部分酶切的话,时间应该不能太长,可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。

要将PCR片段连入表达载体中,选的是TaKaRa的BamH I和Hind III,请问这个双酶切是在37度反应还是30度,要酶切多长时间?PCR片段比较难切吗,引物两端都各加了3个保护碱基?

参考见解:一般37度2小时就行,在酶切时,由于你所选用的酶都是效率比较高的,酶切一个小时就已经足够了。不过若不放心,过夜也没问题。buffer需要共用buffer(比如Y buffer)。PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰当,酶切应该不成问题。PCR产物,由于浓度较低,并不难切,只是在连接转化时难以成功。BamH I一般加CGGGATCCCG的酶切效率高达90%。其它酶的具体情况可以查NEW ENGLAND BioLabs的目录。按new england biolab的介绍,hindIII切割的时间较长,如果,直接切pcr产物再连接有时效率不高,导致转化效率低。如果有条件的话,可以先做at克隆,再酶切。TaKaRa的产品目录的A部分里有关于双酶切所用buffer的详细说明,最好依照执行。

PCR反应后,是否可以直接用来酶切,而不需要从凝胶上回收后再酶切!酶切后直接在4%琼脂糖凝胶上电泳分型,有四种片段91,83,72,48BP,想用凝胶电泳对其六种表现型分型,不知可行否?

参考见解:理论上是可行的但是主要取决于PCR产物与酶切产物的大小差距,差距太小不容易获得很纯的片断,为什么不在酶切后连在载体质粒上呢,再筛选阳性克隆,是否作表达?至于看六种表型建议用PAGE胶电泳做SSCP,用银染分辨率高,可能能解决问题。

PCR产物经过酶切连接到载体上,所用酶切位点是(BamHI,EcoRI)均有8个保护碱基。但是无论怎么切,总是连接不上?什么原因?

参考见解:

1、 PCR产物是否经过纯化了?PCR产物中有较高的离子强度,会影响酶切,如果不经过纯化,则酶切体系中的PCR产物应该适当减少。

2、 vector是T-vector还是其他的,如果是其他的话,那要考虑vector在酶切时,是否是切完全了的,将PCR产物测序,看是否有要的酶切site.

3、 虽说有这么多的保护碱基,假设它们对酶切足够的,但也要遵循其它的条件,如这两个酶在做双酶切时,是否用了它们能通用的缓冲液?也就是说这两种在这种缓冲液中必须要有足够的酶切效率。有两种方法可以上试:(1) 分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到了最大的酶切效率。(2) 克隆到T载体中。不知道加的是什么保护碱基,是不是有足够的保护作用?克隆到T载体中,则不要考虑受这个条件的限制。

4、 按照NEB公司推荐的保护碱基经验,BamH1和EcoRI前加CG就够了,用不着加那么多。当然,加那么多不大会是试验失败的原因。

5、 BamH1和EcoRI都是甘油浓度敏感型的,就是说酶量加的太多了会引起Star活性。不知你的酶切体系如何设定的。

6、 先检查设计引物设计中酶切位点是否正确,然后再重复一次。当然先连到T载体是万无一失,但是克隆周期也延长了。

加了保护碱基,却切不动?

参考见解:

1、 酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液,它们的差别只是离子浓度与体系的不同,如Na、k、Mg等,还有PH值及缓冲体系(一般Tris-HCl),另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液,要达到高酶切效率,选择是个问题,如果酶切时间和量足够,解决的方法:

1) 使用其中一个酶的缓冲液,但要考虑到另一酶的反应效率,反应效率如何,可以查查酶在不同buffer里的效率参数,具体见公司网站,如NEB提供了很好的buffer参数:

2) 使用它们的通用的缓冲液,使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率;没有通用的BUFFER怎么办呢? 分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐,这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率,但缺点是要回收,损失大 ;

3) 克隆到T载体中,值得推荐的方法,克隆到T载体中,不须要考虑受这个条件的限制,酶切位点也可以用T载体上自带的。

2、 酶切温度。酶切温度也很重要,一般的酶切最适温度为37度,有些特殊的酶的反应温度不同,如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切,先低温后高温。

3、 酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全,一般为1-3h,这个时间已经足够,对于一些活性较好的酶,30min就可以酶切完全,建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率;PCR产物的酶切时间较长,一般过夜。

4、 酶失活。如果使用酶解冻后放置太久,可能导致酶失活。这种情况较少见,只能换新酶。如果拿了不同公司的酶,buffer也不一样,怎么办?放心,可以用不同公司的酶进行双酶切,一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比,选择它们都有适中活性的buffer,每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的!

5、 酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度,在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图,尤其插入的是小片段DNA,酶切后产物量较少,可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量,建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓,做到心中有数。

要将目的片段插进载体,选择的酶切位点是Xho1和EcoR1,但是这两个位点共用一个碱基G,即CTCGAGAATTC。还有一对位点是Xba1和Sal1,中间没有空,即TCTAGAGTCGAG。请问这两种情况能不能切开,或是只能通过单酶切来实现?

参考见解:

1、 还是有可能切开的,双酶切不行就分开切试试。再不行,又实在想用这个载体的话,可以变通一下。设计一个短片段DNA,两头带EcoR I的粘性末端,与EcoR I酶切后的载体连接,获得新的载体,以后再做就不会遇到这个问题了。

2、 可以先接上一个片段,再做两次单酶切。例如:载体用BamH I切开,连上两端都是BamH I末端的一个片段------->用EcoR I酶切,回收后再用BamH I切。

3、 先用BamH I和EcoR I同时双酶切试试。不行的话,就先用BamH I酶切再用EcoR I酶切。

怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切?

参考见解:酶切后作个质粒自连实验,在感受态、连接酶等没问题的情况下,如果没有菌落长出,说明双酶切是成功的。当然,如果只长了很少的菌落,也是可以的。如果长了很多的菌落,那说明酶切不完全,这时候就只有一个酶切位点切开了,质粒发生了自连。

目的片段连pET32a ,16度过夜,酶连体系为目的片段5μl,载体3μl,T4连接酶1μl,10*Buffer1μl.转化后涂LB-AMP平板,过夜平板长有菌落,但菌落不大,都很孤立,挑取菌落于LB-AMP液体摇菌过夜,试剂盒提取质粒后电泳一片弥散,无目的条带,这是哪个步骤出问题了?

参考见解:

1、 觉得是连接体系可能有问题,目的基因并没有跟载体连上,之所以长菌是由于AMP抗性的筛选压力不够,长了杂菌。

2、 连接体系可能还需要再考虑,首先是目的片断与载体应该是摩尔数之比为3:1~6:1;其次转化是否也存在问题?即使是空质粒也是有条带的。还有可以在转化质粒时,以空质粒为对照这样来比较。

电泳了纯化后的目的片段和载体都有,但载体没目的片段亮,酶连时是不是需要测核酸浓度后再算体积比?

参考见解:必须计算浓度来估计:

质粒加DNA浓度计算:

质粒    PCR产物

电泳后浓度(OD值)  A(18)  B(14)

相对分子量   C(7300)  D(100)

摩尔浓度   A/C  B/D

体积比  x  y

x.a/c/(y.b/d)=1/3=>x/y=bc/3ad(x+y=12Ul,水为12μl)

x/y=16/1,x+y=12

x=16ul,y=1ul

hPer11μl  1μl

PGBKT7 16μl  16μl

T4 ligase 1μl 混匀

10*t4 ligase  2μl

水  12μl

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