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提取土壤总DNA的几种方法

标签: 土壤总DNA

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一、DNA 提取 

SDS 高盐法(方案1)

具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L  EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L  NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L  ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r?min - 1振荡30 min ;加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15~30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r?min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次;用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r?min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r?min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中。

变性剂加SDS 高盐法(方案2) 

具体步骤: 取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L  Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L  EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次;转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L  NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r?min - 1 离心10 min ,取上清;在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r?min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20~25 ℃,12 000 r?min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀.

SDS-酚氯仿抽提法(方案3)

具体步骤:称取1g土壤样品,加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液,玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg,使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min,加125μl 20%SDS振荡处理15min,离心,分装EP管,加酚(1:1体积),抽提1次,氯仿-异戊醇(1:1体积),抽提2次,加0.6体积异丙醇,室温放置1h,离心,70%乙醇清洗,200μl TE 溶解。

冻融溶菌酶SDS裂解法(方案4)

具体步骤:取1g土壤样品,加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0), 加玻璃珠旋涡5~10 min,在液氮中冷却1 min后迅速在沸水中煮2 min,如此重复3次,13 000r/min离心10 min。上清夜快速置于冰上备用,沉淀用于进一步裂解。将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中,旋涡10min,加入溶菌酶(100ml/l)50μl,轻轻混匀后,37℃温浴30min,再加入250μl SDS 缓冲液(100 mmol/l Tris-HCl, 200 mmol/l NaCl,2.0% SDS, PH8.0),上下颠倒10min,13000 r/min离心10min,收集上清夜。

二、DNA 纯化

葡聚糖-200凝胶G离心层析纯化

取2ml灭过菌的一次性塑料注射器,用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部,使其厚度约为0.5cm,然后向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200,制成简式离心层析柱,再置于10ml的离心管中,于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min,去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液,将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中,在离心层析柱顶部加入50μl粗土壤DNA ,以10 min为周期于3000r/min离心,分别收集层析液。层析液浓缩至50μl

三、DNA的琼脂糖凝胶电泳

证明存在DNA 。

四、DNA 的纯度和定量检测

用紫外分光光度计测量纯化后的DNA 溶液在波长为230 nm、260 nm、280 nm 下的OD 值,分别算出A260/A230及A260/A280值。来估计DNA 的纯度。

五、纯化后土壤DNA 的PCR扩增

PCR 反应体系为50μl ,模板为1μl。PCR反应引物(放线菌通用引物):

反应条件: 94 ℃ 3 min 预变性; 94 ℃ 1 min , 56 ℃1 min ,72 ℃1 min ,30 个循环;72 ℃补平5 min。PCR 产物用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测。

六、检测扩增结果

凝胶电泳,用溴乙锭染色,在紫外光下检查结果。

 

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