一、目的与原理 当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时,即为感受态,而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。 二、材料和方法 1. 材料:大肠杆菌 2. 仪器: 离心机,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜 3. 试剂 LB培养基,0.1M MgCl2,3mM氯化六氮合高钴 TFB:10Mm MES(pH6.3) 45Mm MnCl2 10Mm CaCl2 10Mm KCl 三、操作步骤 大肠杆菌在LB培养基平板上划线培养12-16小时,挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌到对数期。取1ml培养物7000rpm,离心3min,收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体,冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙(或TFB),放置于冰浴,即得感受态细胞,此细胞可现用,也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中,投入液氮,然后储于-70℃保存。 四、结果 (略) 五、注意事项 一般地,新制备的感受态细胞48h后转化效率降低,15d后失效。因此,感受态细胞不能保存太久,4℃保存一周,但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔,损伤感受态细胞。 |
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