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再扩增VH基因文库添加3‘限制性位点并克隆创建VH基因节段文库

标签: 再扩增VH基因文库 限制性位点 克隆 VH基因节段文库

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[器材和试剂]

●  PCR试剂和设备

●  Wlzard PCR纯化试剂盒(Promega)

●  PVHlOR2引物:  5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CGC GCA GTA ATA CAC GGC CGT GTC-3,

●  PVH3FOR2引物:5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CIGC GCA GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTC-3'

●  PVH5FOR2引物:5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CGC GCA GTA ATA CAT GGC  GGT GTC CGA-3'

●  胶纯化VH基因文库 (25ng/ul)

●  用于scFv基因文库限制性消化的试剂和设备

●  用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌的试剂和设备。

[方法]

1. 配制3个各自独立的50ul PCR反应混合液,包含:

●  水,34.5u1

●  20×dNTPs(每种5mmol/L),  2.5ul

●  10×Vent聚合酶缓冲液,l 0ul

●  LMB3引物(10pmol/u1),2.5ul

●  FORWARD引物  (10pmol/ul),2.5u1

●  VH基因文库 (25ng/u1),2.0u1

●  Vent DNA聚合酶(2单位),1.0ul

2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应物到94℃ 5分钟。

3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次,再次扩增VH基因。

4. 用Wlzard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。

5. 用NcoI和NotI消化PCR产物。

6. 将消化的PCR产物连接到NcoI/NotI消化的pHENl中,并电转化到大肠杆菌TGl细胞中,建立3个VH基因片段噬菌体丈库。测定文库容量并将细菌性丈库材料储存于-70℃。

7. 从每种VH基因文库中制备DNA:用含甘油丈库储存材料细菌接种到含l00ug/m1氨苄青霉素和1%葡萄糖的100m1 2×TY培养基中。接种量应足够大以保证接种细菌数至少比文库容量大5倍。过夜培养后,按标准的DNA质粒制备方法进行操作。为了续后进行文库消化,可合并不同丈库的DNA.

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