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一.实验目的 1.掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2.学习DNA的限制性酶切的基本技术 3.掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二.实验原理 1984 年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组 成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA 指纹图谱，开创了检测DNA 多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP （限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD （随机扩增多态性 DNA ）分析等等。各种分析方法均以DNA 的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA 指纹图谱，由于DNA 指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。
DNA 指纹具有下述特点：1.高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA 图形的概率仅3 × 10 -11 ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5 × 10 -19 。全世界人口约50亿，即5 × 109 。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA 指纹的图形完全相同。2.稳定的遗传性：DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA 指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递 50 ％ 给子代。3.体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA 指纹图形完全一致。 1985 年Jefferys 博士首先将DNA 指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA 指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA 指纹技术具有许多传统 法医检查方法不具备的优点，如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA 来作分析；如果用线粒体DNA 检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA 指纹技术。 此外，它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。 DNA 指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA 一般都有部分的降解），可运用PCR 技术扩增出高可变位点（如VNTR 系统，串联重复的小卫星DNA 等）或者完整的基因组DNA ，然后将扩增出的DNA 酶切成DNA 片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA 探针与膜上具有互补碱基序列的DNA 片段杂交，用放射自显影便可获得DNA 指纹图谱。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料- 溴化乙锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA 条带，用于各种克隆 操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp 至近50kbp的DNA 。长度100kb 或更大的DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 |
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在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 三 . 实验材料和试剂 1.DNA 样品：犯罪现场DNA 样品（CS）、嫌疑犯1DNA 样品（S1）、嫌疑犯2DNA 样品（S2）、嫌疑犯3DNA 样品（S3）、嫌疑犯4 DNA 样品（S4）、嫌疑犯5DNA 样品（S5） 2. 化学试剂和溶液 （1）DNA 样品反应缓冲液：100mM Tris, 200mM NaCl, 20mM MgCl2 , 2mM DTT, pH 8.0 。 （2）Eco RⅠ限制性内切酶 （3）Pst Ⅰ限制性内切酶 （4）电泳缓冲液 （50 ×TAE） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml EDTA （0.5mol/L pH 8.0）100ml 使用时用蒸馏水稀释50倍。 （5）样品缓冲液（DNA sample loading dye ） 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青 40% （W/V）蔗糖 （6）溴化乙锭（EB）10mg/ml （7）琼脂糖 agarose （电泳级） |
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（8）DNA 分子量标记物：Lambda Hin d Ⅲ DNA markers 3. 仪器设备和消耗品 电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器（10μl ，200μl ，1000μ ）、离心管、一次性枪头（200μl ，1000μl） 。 四 . 实验步骤 1.DNA 样品的制备 采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37℃孵化数小时，消化蛋白质分离DNA；使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA ；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀DNA 。 由于一般采集的样本中的DNA 都有不同程度的降解，采用PCR 技术扩增出完整的基因组DNA 或者特定的高可变位点，以此制备出的 DNA 样品备用。 2.DNA 样品的酶切反应 设置DNA 样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）： 反应管 对照管 样品 DNA 10 10 反应缓冲液（10 ×） 2 2 双蒸水 6 8 Eco R Ⅰ 1 0 Pst Ⅰ 1 0 总体积 20 20 加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1小时，取出备用。 3.酶切产物的琼脂糖电泳 （1）在100ml 电泳缓冲液（1TAE 或0.5TBE）中加入1g琼脂糖，加热熔化，注意观察，当心煮沸的液体，溢出！当凝胶冷却至60 ℃ 左右时加入5μl 溴化乙锭溶液终浓度为（1μg/ml），充分混匀。 （2）先用透明胶带封固胶托边缘，放好梳子，然后再倒入凝胶（凝胶厚度在5mm左右）。 （3）在凝胶完全凝固后（室温放置30-45分钟），小心移去梳子和透明胶带，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（液面超过胶带约 2-3mm）。 （4）取已制备好的酶切DNA 样品，加入1/5 样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入 DNA 分子量标记物，对照以及酶切 DNA 样品各5-10m l 。 （5）盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用50-100伏），电泳40-60 分钟（注意：DNA 样品从负极向正极泳动）。 4.结果观察与分析 关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察DNA 的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA 样品是同一个样品，找出罪犯。 五. 注意事项 （1）酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。 （2）进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头 。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱。 （3）溴化乙锭是一种强烈的致癌物质，使用时必须带手套 。实验结束后，含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。 |
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