生命经纬知识库 >>所属分类 >> DNA技术   

DNA连接实验原理

标签: DNA连接实验 DNA连接

顶[1] 发表评论(0) 编辑词条

DNA分子的体外连接就是在一定条件下, 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程, DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此,必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度,以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平,此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应,也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸(未脱磷),可形成4个新的磷酸二酯键;如载体DNA已脱磷,则只能形成2个新的磷酸二酯键,此时产生的重组DNA带有两个单链缺口,在导入感受态细胞后可被修复。

1、不对称粘性末端:两种限制酶消化后,需纯化载体以提高连接效率;载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;非重组克隆的背景较低;外源DNA可以定向插入到载体中。

2、对称性粘性末端;线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理;载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;外源DNA会以两个方向插入到载体中。

3、平端:要求高浓度的DNA和连接酶;载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;非重组克隆的背景较高 。

粘性末端连接:

实验试剂:

用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要,可用凝胶电泳分离片段并(或)用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚:氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

10×T4DNA连接酶buffer(该缓冲液应分装成小份,贮存于-20℃。):200mMTris-HCl(pH7.6);50mMMgCl2;50mM二硫苄糖醇;

500μl/ml  BSA(可用可不用)

T4DNA连接酶

5mM  ATP

实验步骤:

1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液:

1) 10μl体积反应体系中:取载体50-100ng,加入一定比例的外源DNA 分子(一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5),补足ddH2O 至8μl。

2) 轻轻混匀,稍加离心,于45℃水浴5分钟使重新退火的粘端解链, 迅速将混合物转入冰浴。

3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl,T4 DNA连接酶合适单位, 用ddH2O 补至10μl。

2、盖上管盖,充分混匀,台式离心扣上离心5秒。

3、12℃下过夜连接反应。

4、反应结束后于-20℃保存。

5、再设立两个对照反应,其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。

注意事项:

1、连接反应的温度:DNA连接酶的最适反应温度为37℃,但在此温度下, 粘性末端的氢键结合很不稳定,折衷方法是12℃过夜。

2、DNA的平未端和粘性末端:由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端,因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高,因而在底物浓度,酶浓度选择上是有差异的。

3、 碱性磷酸酶处理质粒载体:为了提高连接效率,一般采取提高DNA的浓度,增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题, 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理,除去其5’末端的磷酸基,防止环化, 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

4、连接反应的检测:连接反应成功与否,最后的检测要通过下一步实验,转化宿主菌, 阳性克隆的筛选来确定。

5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇丙烯酰胺胶分离DNA 下一篇DNA 3D Structure Model

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
1

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条