生命经纬知识库 >>所属分类 >> DNA技术   

克隆心得―帮助新手快速做出克隆

标签: 暂无标签

顶[0] 发表评论(60) 编辑词条

本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创,我在其基础上进行了一些改动,主要是DNA回收上采取了更简单的方法。(本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆 的情况。对于分步酶切制作片断,也可以使用本方法,但需要加倍起始酶切DNA的量。)

一、片断平移的克隆 (也适用于多片断连接)

简介:将用作载体的质粒A(制作大片断)酶切3μL ,要切出小片断的质粒B酶切7μL;琼脂糖回收胶电泳;切胶回收来自质粒A的大片段,和来自B的小片断,并回收到一管中;酚氯仿法回收DNA,酒精沉淀,干燥;加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ,4℃过夜;次日转化涂板。

酶切

配置可酶切共10μL质粒的酶切反应体系(双酶切):

(提示 在克隆 设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效价高、便宜量大的酶>,且注意这两个酶有比较兼容的Buffer,即在这种公用Buffer中,两酶的效力变化不大<至少保持60%的活性>。酶切体系根据需要,可加入BSA。)

酶切体系

A质粒酶切-制作载体片断

公用Buffer 3μL

酶 I 1μL

酶 II   1μL

质粒   3μL

双蒸水   22μL

合计   30μL

B质粒酶切-制作插入片断

公用Buffer 7μL

酶 I   2μL

酶 II   2μL

质粒   7μL

双蒸水   52μL

合计   70μL

混匀

37℃,酶切3小时。

(提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μL左右,3μL内切酶相当于30U,足够切10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200-600ng/μL,一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶切1μg质粒的原则,这一酶量是足够的。)

1%琼脂糖回收胶回收(碎胶、酚氯仿抽提法)

1. 酶切产物加入10%量的上样Buffer,混匀。使用1%的琼脂糖回收胶,电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断(载体)和小片断(插入片断),收入一个1.5mL离心管中。(提示: 切胶前,需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面,以防污染。 手术刀要火焰消毒,而后切胶回收。)

3. 12000rpm 1分钟,将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μL Tip 头两只,在酒精灯上稍烤化Tip头尖端,两Tip头尖相对来回相接触,在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头,准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶,立即使用200μL枪套上平头Tip头,捣碎凝胶。(提示 200μL的枪足够粗壮,不要用100μL的枪,小心折断!!! 乘凝胶比较硬时就开始碎胶,轻而频率高地捣碎凝胶)

6. 凝胶管中加入500μL双蒸水,盖紧,振摇200下。

7. 加入500μL Tris饱和纯酚,盖紧,振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿:异戊醇(24:1),将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧,振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。

9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。(提示 吸取步骤8中的上清时,千万不要将有机相吸入,宁可放弃一些上清,否则影响后面的连接反应。 另外,本方法使用的醋酸钠量较小,但足够沉淀核酸,并且无需洗盐。)

10. 弃上清,将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。(提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集,可盖好管盖后,轻弹管底数次,将液体分散挂在管壁上,再打开管盖吹风。)

连接

向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水,盖紧,弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底,再加入1μL ligase Buffer,1μL T4 ligase(连接酶)。弹击管壁混匀,瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 (提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装,每管可2-3μL,-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆 。)

二、PCR产物接入质粒的克隆

简介: 取100μL PCR产物,酒精沉淀、干燥,直接加入酶切体系酶切;将用作载体的质粒A(制作大片断)酶切3μL;切胶回收来自质粒A的大片段,和来自PCR产物的小片断,并回收到一管中;酚氯仿法回收DNA,酒精沉淀,干燥;加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ,4℃过夜;次日转化涂板。

PCR产物回收

1. 制备100μL PCR产物。

2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中,再加入400μL双蒸水,颠倒混匀。加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。(提示 本方法使用的醋酸钠量较小,但足够沉淀核酸,并且无需洗盐。)

3. 4℃静置30分钟,以利于核酸沉淀。

4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟,沉淀核酸。

5. 弃上清,将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。(提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集,可盖好管盖后,轻弹管底数次,将液体分散挂在管壁上,再打开管盖吹风。)

酶切

直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系:

PCR产物酶切-制作插入片断

公用Buffer 6μL

酶 I   3μL

酶 II   3μL

PCR产物   ——

双蒸水   48μL

合计   60μL

要将PCR产物接入的质粒载体A,取A质粒3μL进行酶切。

A质粒酶切-制作载体片断

公用Buffer 3μL

酶 I   1μL

酶 II   1μL

质粒   3μL

双蒸水   22μL

合计   30μL

混匀

37℃,酶切3小时。

1%琼脂糖回收胶回收(碎胶、酚氯仿抽提法)

1. 酶切产物加入10%量的上样Buffer,混匀。使用1%的琼脂糖回收胶,电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断(载体)和小片断(插入片断),收入一个1.5mL离心管中。 (提示 切胶前,需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面,以防污染。 手术刀要火焰消毒,而后切胶回收。)

3. 12000rpm 1分钟,将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μL Tip 头两只,在酒精灯上稍烤化Tip头尖端,两Tip头尖相对来回相接触,在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头,准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶,立即使用200μL枪套上平头Tip头,捣碎凝胶。(提示 200μL的枪足够粗壮,不要用100μL的枪,小心折断!!! 乘凝胶比较硬时就开始碎胶,轻而频率高地捣碎凝胶)

6. 凝胶管中加入500μL双蒸水,盖紧,振摇200下。

7. 加入500μL Tris饱和纯酚,盖紧,振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿:异戊醇(24:1),将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧,振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。

9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。(提示 吸取步骤8中的上清时,千万不要将有机相吸入,宁可放弃一些上清,否则影响后面的连接反应。 另外,本方法使用的醋酸钠量较小,但足够沉淀核酸,并且无需洗盐。)

10. 弃上清,将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。(提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集,可盖好管盖后,轻弹管底数次,将液体分散挂在管壁上,再打开管盖吹风)

连接

向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水,盖紧,弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底,再加入1μL ligase Buffer,1μL T4 ligase(连接酶)。弹击管壁混匀,瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 (提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装,每管可2-3μL,-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆 。)

三、 一步法感受态细胞制作 (已经检验过DH5α和BL21系菌,采用此方法的转化效率足够高)

来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580

Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.

Chung CT, Miller RH.

下载链接:http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520&pageindex=1

(提示:建议首次使用本方法时,先培养20mL菌,可得到总数2mL的感受态菌,足够作30次转化。制作感受态细胞时注意无菌操作。)

1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。

2. 4℃ 3000g(或6000rpm) 5分钟。弃上清,收菌。

3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。

4. 冰上置10分钟。 分装,每管60μL,置冰上。放入-70℃冰箱。(提示 每次使用拿出一管,避免反复冻融。 -70℃可保存一年不影响转化效率)

TSB配方(需高压):

LB (PH6.1)

10%  PEG 3350

5%  DMSO

10mM  MgCI2

10mM  MgSO4

10%  甘油

* TSB 的配置同原文稍有改动,即把甘油加入TSB并一起高压(简化步骤)。实践数次证明对于感受态制备没有影响。

5×KCM溶液配方:(配置数毫升即可,-20 ℃保存,可反复冻融)

0.5 M  KCI

0.15M   CaCl2

0.25M  MgCI2

转化Protocol:

1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL,(共50μL)混匀,置冰上。

2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞,置冰上。融化后立即取50μL,加入步骤1中的混合液中,轻轻吹打数次混匀(不可用力过大,不可涡旋), 立即置冰上。

3. 冰上放置20 分钟。

4. 室温放置10分钟。

5. 加入500μL新鲜LB, 150转37 ℃ 1小时。

6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清(其余上清丢弃),吹打数次,重悬菌体。

7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。

(提示:可使用质粒转化该感受态细菌,检验转化效率。1μL的质粒转化,DH5α菌板满板不可计数;BL21菌板有200-300个菌落。)

小结:

本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中,而不象一般的操作分别收到不同的试管中,回收后再电泳定量,并计算大小片断的比例,最后配置连接体系。

这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差(例如肉眼对DNA的定量的误差),还减少了DNA的损失,保证了更多的DNA(实际上是全部的DNA)进入下面的连接反应。

所以本方法的第一个优点,是保证连接和转化中,有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证,克隆 成功就得到保证。

例如本方法中,制作大片断的A质粒取3μL,对于通常的小提质粒,3μL意味者600-1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是50-200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半,仍然剩300-900ng。实际上,使用本方法,在片断平移的克隆 中,如果把转化的菌液全部涂板,得到的克隆 多得不可计数;片断平移克隆 实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆 效率没有那么高,但是一般也达到40-60转化子/平板。

本方法的另一优点,是这些看起来固定的步骤,例如酶切、酶连、以及转化等方案,实际上已经遵循了很多原则,而且这些步骤之间互相平衡,组成一个很稳定和可操作性很强的系统。

例如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL:7μL,已经隐含了载体:插入片断=1:2~3的比例(PCR克隆 经折算后大概是1:5~10)。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素,最后回收在试管中的大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。

酶切使用的酶量,是经过计算的。可以保证是采用3-5倍的量切割质粒或PCR片断,因此可以保证酶切反应的效率。

连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点,18 ℃ 3小时已经足够。

Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法,可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。

因此,这套方法考虑到了克隆 的每个重要环节,并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力,或者说,它的系统冗余比较大,保证了这套方法极高的成功率。

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇生物芯片技术探秘 下一篇DNA酶切

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条