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DNA酶切

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一、 DNA 酶切反应

1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加,漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。

2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。

3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。

二、DNA 分子量标准的制备

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA 片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA 为长度约50kb的双链DNA 分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA 后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA 后得到6个片段,长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。

三、 琼脂糖凝胶的制备

1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。

2、胶液的制备:称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

3、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。

  向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4、加样:取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA 含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

5、电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。

6、染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。

7、观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上,采用全色胶片,光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。

8、DNA 分子量标准曲线的制作:在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA 的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA 分子量的标准曲线。

9、DNA 酶切片段大小的测定:在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA 样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA 分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA 片段的大小)。反之,若已知DNA 片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。

10、DNA 酶切片段排列顺序的确定:根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA 酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA 分子的限制性内切酶图谱。

[注意]

1.酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大,否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。

2、酶活力通常用酶单位(U)表示,酶单位的定义是:在最适反应条件下,1小时完全降解1mg lDNA 的酶量为一个单位,但是许多实验制备的DNA 不象lDNA 那样易于降解,需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的,除考虑成本外,酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

3、市场销售的酶一般浓度很大,为节约起见,使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释。另外,酶通常保存在50%的甘油中,实验中,应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下,否则,酶活性将受影响。

4、观察DNA 离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA 分子有切割作用。从胶上回收DNA 时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫外光切割DNA 。

5、EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

6、当EB太多,胶染色过深,DNA 带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。

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