基因治疗的概念：基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞(target cells)内，他们或与宿主细胞(host cell)染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。

发 展：Edward Tatum 和Joshua Lederberg 在60年代曾提出可利用病毒作为基因转移的载体。

1989年5月，NIH Rosenberg实验室首次开展人体基因转移实验

1990年9月， Blease等首次成功地实现了对SCID病人进行基因治疗 （腺苷酸脱氨酶缺乏症 adenosine deaminase deficiency） 。近10年来，已有4000多病人接受这种治疗。

一、基因治疗的方式

1、基因置换（gene replacement）

2、基因修正（gene correction）

3、基因修饰（gene augmentation）

4、基因失活（gene inactivation

5、免疫调节 (immune adjustment)

基因置换（gene replacement）：基因替换用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。

基因修复（gene correction）：基因修正，是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。

基因修饰（gene augmentation）：基因补充，又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血栓形成。

基因失活（gene inactivation）：利用反义技术、核酶技术或基因敲除技术（knock-out）封闭有害基因，能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。

1）反义核酸技术：用与目的基因或目的基因的mRNA互补的核酸，在复制、转录、翻译水平上抑制目的基因的表达。

2）核酶技术：利用核酶的催化活性将mRNA特异地剪切，从而不能承担翻译的模板作用。

免疫调节(immune adjustment)：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。

自杀基因的应用：

某些基因的表达产物（酶）能将无毒、或低毒的核苷酸类化合物代谢成特殊中间产物，并进一步生成细胞毒性物而导致细胞死亡。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因，然后给予病人无毒性环氧丙苷（gancidovir，GCV）药物，由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。

基因治疗的分类：

1、生殖细胞基因治疗：将正常基因导入患者的生殖细胞，传代，有伦理学问题。

2、体细胞基因治疗：将正常基因导入患者的特定 组织细胞中，纠正基因缺陷。

有两种方式：修复基因的缺陷部位或导入正常基因。

二、基因治疗的程序

1、目的基因的获得：基因克隆、人工合成、PCR扩增以及基因组的降解等方法。目的基因可以来自人类基因组或cDNA。目的基因必须置于启动子的控制下，还需要有信号肽序列使其分泌到胞外。用标记基因监测目的基因。

2、受体细胞的选择： 一般用体细胞（病变或非病变）作为受体，可选用淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝脏细胞甚至是肿瘤细胞。

3、基因转移方法：导入基因有两种方法，一种是回体法（ex vivo）：在体外将目的基因导入细胞内，再将这种细胞回输给病人；另一种是在体法（in vivo）：将外源基因直接导入体内有关的组织器官。

4、载体的选择：将目的基因置于启动子调控序列下。

常用的载体有：质粒载体（穿梭质粒） 、 病毒载体

5、基因导入的方法：

（1）脂质体介导法

（2）受体介导法

（3）理化方法：DNA-磷酸钙共沉淀法 、显微注射法 、电穿孔法 、基因枪

（4）病毒介导的基因转移：反转录病毒 、腺病毒 、腺相关病毒等。

6、转导细胞的选择与鉴定：

（1）标记基因技术：目的基因与标记基因同时重组到同一载体，如neor抗药基因可作为标记。

（2）基因缺陷型受体细胞的选择：将正常基因导入基因缺陷行靶细胞，用选择性培养基筛选。

（3）共转染技术：目的基因表达载体与标记基因表达载体混合，经两次筛选可得到转化细胞。

（4）分子杂交鉴定：目的基因和标记基因片段作探针（标记基因片段作探针更佳） 。

三、基因治疗的程序

1、遗传性疾病：如ADA缺乏引起的严重联合免疫缺陷症（SCID）、镰刀状贫血、血友病、地中海贫血、帕金森氏症、苯丙酮尿症等。

2、恶性肿瘤：采用反义技术抑制和封闭癌基因，也可增补抑癌基因的作用。

常用基因修饰的TIL（tumor infiltrating lymphocyte）：

回体法、基因修饰的肿瘤细胞、自杀基因的应用。

3、病毒性疾病：肝炎、AIDS等，应用基因转导分泌抗病毒因子或用反义技术封闭病毒基因的表达。

（Ⅱ）、基因治疗中治疗基因的定向运送和受控表达

背景：由于人类基因计划取得了超乎预想的进展，后基因组计划，功能基因组计划，以及蛋白质组计划等等被相继提出。人们对自己的遗传背景有了更清楚的认识，特别是对基因与疾病的关系有了进一步而具体的了解。于是，由基因入手从根本上治疗人类的疾病，即基因治疗，成为近年来极具吸引力的研究课题和应用技术。